Seahorse海马代谢仪使用说明培训课件

背景生物能量学（Bioenergetic）

探讨的是生物将氧份转为能量并借此推动生命的过程。不同的细胞依据其生理特性及健康状况，能量供需系统亦有所不同。1Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023简介

美国海马生物科学利用细胞外流量（ExtracellularFlux，XF）检测专利技术，发明了业界第一款海马细胞能量代谢实时测定仪/生物能量代谢测定仪（SeahorseXFExtracellularFluxAnalyzers），是进行细胞代谢分析、氧呼吸测定、药物代谢分析、线粒体有氧代谢和糖酵解等功能的最佳分析工具。特点：通过特殊的细胞培养微孔板设计，在测量时临时形成的约2ul微环境中，利用无创的专利光学传感器同步地实时探测溶解氧（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）变化，从而快速了解细胞内两大能量转换途径（线粒体的有氧代谢和糖酵解）的能量代谢状态。2Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/20233Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023仪器外观4Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023HydroBoosterSensorCartridgeCartridgeLid耗材5Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/20236Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023自动药物注射端口启用实时功能分析7Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023CellMitoStressTestAssayKits8Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023水化探针1.在UtilityPlate每孔中加入1ml校准液(SeahorseXF校准液用于溶解和校准XF小柱，并包含FluxPak)实验前一天9Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/20232.将HydroBooster放在UtilityPlate上，SensorCartridge放在最上面10Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/20233.放入无CO2的培养箱，37℃过夜（使校准液能浸没在sensors中；保证培养箱湿度，防止干燥）11Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023培养细胞1.100ul培养液收集细胞，按最佳细胞密度重悬细胞（10,000-80,000个细胞/孔）。2.每孔接种100μL细胞悬液，背景校正孔（A1,B4,C3,D6）不接种细胞。将细胞板室温静置在超净台上1h。3.将细胞板放置在细胞培养箱中让细胞贴壁（快1h；慢5-6h），在显微镜下观察细胞是否贴壁。4.细胞贴壁后，每孔加入150μL生长培养液，总体积为250μL。加液时，沿壁轻轻加入，避免吹起刚贴壁的细胞。5.将细胞放置在细胞培养箱中过夜培养。在显微镜下观察细胞的生长状态。

12Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023预热仪器打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37℃，过夜预热。13Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023准备XF检测液一个培养板手动加液需100ml，仪器加液需200ml1.使用NaOH调节pH值至7.35±0.052.检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。3.37℃放置备用。NOsodiumbicarbonateLowphenolred(3mg/L)实验当天14Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023处理细胞1.将细胞培养板从CO2培养箱中取出，并记录时间。2.在显微镜下观察细胞（无污染，细胞均匀状态好，贴壁未脱落，背景矫正孔无细胞。）3.用XF细胞线粒体压力测试检测液洗细胞：a.吸去生长培养液至每孔剩余50μL。b.用1mLXF检测液洗细胞两次。c.每孔加入检测液至终体积为500μL/孔。4.在显微镜下观察细胞，确认细胞在换液过程中没有脱落。5.将细胞板置于37°C无CO2培养箱中1h。15Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023配制XF细胞线粒体压力测试盒中药物母液16Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023

检测液体积终浓度Oligomycin630μL100μMFCCP720μL100μMRotenone/AntimycinA540μL50μM17Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023将药物稀释为10×浓度，用于加到加药孔中

3.取300μL50μMrotenone/antimycinA母液至2700μL检测液中。2.按以下表格，用检测液将FCCP稀释为不同的浓度1.按左边表格，用3mL检测液将oligomycin稀释为所需浓度（或使用大多数细胞都适用的1μM）。18Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023加药从无CO2培养箱中取出已水化的测试板。按以下说明，将药物分别加到每个加药孔里。加药孔A：细胞孔内oligomycin终浓度为1μM。每个A孔加入56μL10×药物。加药孔B：测定浓度的FCCP。将62μL10×的不同浓度药物加入到B孔里。加药孔C：细胞孔内Rot/AA终浓度为0.5μM。每个C孔加入69μL10×药物。19Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/202320Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023选择模板（提前预热）21Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023Injectionstrategies---add---strategy1----A----add----mitostresstest1BC同样22Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023Pretreatment----add-----不用做修改23Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023AssayMedia-----MitoStresstestmedium24Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023填写相关信息：Name,CellType,Seedingdensity（CellType2，3，4同样），之后点击“GenerateGroup”查看25Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023“PlateMap”设置颜色26Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023默认的Mix-Wait-Measure时间为3min-2min-3min。通常在加药前测量3次基础值；每次加药后再进行3次测量。“Injection”多少种药点多少次27Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023ReviewRun-----PlateInformation-----WellVolume-----Plateby-----StartRun，放入测试板。当软件出现校准完成提示时，将Utility板换为细胞培养板。点击Continue。仪器完成OCR值测定，数据分析。28Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023寡霉素：ATP合酶抑制剂；FCCP：解偶联剂

；

抗霉素A/鱼藤酮：呼吸链抑制剂；29Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/202330Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/202331Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/202332Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023HowdoIknowwhetherthecelldensityisgood?•BasalOCRrange:20-160pmol/min•MaximumrecommendedOCR:400pmol/min•ECAR:5-100mpH/min33Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/202334Seahorse海马代谢仪使用说明7/26/2023优势特点：采用超敏感的生物传感器和非接触式设计，真正实现检测细胞零损伤；实时检测细胞