微生物细胞工程课件

第十三章微生物细胞工程第十三章微生物细胞工程1微生物细胞的特点微生物作为可以独立存在的个体，其生长特点、代谢的特点与植物、动物有着显著的区别。一般情况下，微生物由其自身完成其基本功能；微生物细胞的特点微生物作为可以独立存在的个体，其生长特点、代2微生物菌种选育的目的和意义微生物菌种选育的目的和意义3微生物细胞的改造－育种传统菌种选育技术杂交和原生质体融合技术基因工程定向进化微生物细胞的改造－育种传统菌种选育技术4传统菌种选育技术自发突变育种诱变育种传统菌种选育技术自发突变育种5微生物突变类型变异类型变异性状形态变异菌落形态菌落大小、形态、表面结构、颜色、产孢子多寡或有无细胞形态鞭毛、夹膜、菌丝形状、生长速度、分枝多少及形状、孢子大小和形状、产孢子器官形状细胞结构细胞膜、孢子的表面结构及抗原构造生理生化变异糖类分解能力、色素产生能力、有关酶的活性、营养要求和性质、温度敏感性、代谢产物生产能力抗性变异耐药性、对自身代谢产物抗性、噬菌体抗性、对紫外线及其他辐射因子的抗性等病原性变异病原产生能力、表面抗原等微生物突变类型变异类型变异性6遗传变异类型遗传变异类型细胞核细胞质质粒、噬菌体和线粒体DNA体外重组转化或转染进入宿主细胞中DNA染色体数目（单、双、多倍体和非整倍体）突变重组（转化、转导、接合和融合）点突变（DNA分子中某一个碱基发生顺序或数目的变化所致）区段突变（染色体或DNA片段的缺失、易位、倒位、替换、添加等造成的突变）遗传变异类型遗传变异类型细胞核细胞质质粒、噬菌体和线粒体DN7自发突变育种从生产中育种定向培育优良菌株卡介苗的获得吡哆醇高产菌株的获得自发突变育种从生产中育种卡介苗的获得吡哆醇高产菌株的获得8诱变育种诱变育种的基本环节诱变育种诱变育种的基本环节9谷氨酸棒杆菌的野生型（左）和dapD突变株（右）细胞的电镜照片谷氨酸棒杆菌的野生型（左）和dapD突变株（右）细胞的电镜照10诱变育种中的几个原则挑选优良的出发菌株单一遗传纯菌株选用对诱变剂敏感的菌株选用有应用前景的菌株来自生产中的自发突变菌株选择简单有效的诱变剂及合适剂量处理单细胞或单孢子悬液复合诱变剂的处理诱变育种中的几个原则挑选优良的出发菌株11营养缺陷型的筛选方法1、诱变处理2、淘汰野生型抗生素法青霉素制霉菌素(抑制甾醇的合成)菌丝过滤法(适于真菌和放线菌)3、检出缺陷型4、鉴定缺陷型营养缺陷型的筛选方法1、诱变处理12检出缺陷型基本培养基基本培养基(含菌)基本培养基完全或补充培养基夹层培养法检出缺陷型基本培养基基本培养基(含菌)基本培养基完全或补充培13限量补充法<1%蛋白胨大，野小，变检出缺陷型限量补充法<1%蛋白胨大，野小，变检出缺陷型14逐个检出法完全培养基基本培养基完全培养基检出缺陷型逐个检出法完全培养基基本培养基完全培养基检出缺陷型15培养完全培养基基本培养基影印培养法检出缺陷型培养完全培养基基本培养基影印培养法检出缺陷型16鉴定缺陷型含菌基本培养基含营养物滤纸片生长谱法(氨基酸、维生素、碱基等)鉴定缺陷型含菌基本培养基含营养物滤纸片生长谱法(氨基酸、维生17各种化学诱变剂常用浓度和处理时间诱变剂浓度处理时间（min）缓冲液终止反应方法效

应备

注亚硝酸（液体）0.01~0.1M5~10pH4.5,1M醋酸缓冲液pH8.6,0.07MNa2HPO4溶液脱去碱基中的氨基后引起碱基转换，造成突变有致癌作用，小心操作硫酸二乙酯（液体）o.5~1%(V/V)孢子15~30，菌丝18~24hpH7.0磷酸缓冲液Na2S2O3或大量稀释诱变作用较强，杀菌作用较弱，使DNA的碱基和磷酸基发生烷化作用，引起突变。不溶于水，加微量乙醇可溶解亚硝基胍（固体）0.1~1.0mg/ml，孢子3mg/ml(高浓度及碱性pH)孢子30~120,菌丝90~120pH6.0,1M磷酸或醋酸缓冲液或三羟基甲基氨基甲烷-缩苹果酸缓冲液大量稀释pH低于5~5.5时，同硫酸二乙酯形成亚硝酸，碱性条件下产生重氮甲烷，引起杀菌和变异有致癌作用，小心操作，避光保存，易产生突变群各种化学诱变剂常用浓度和处理时间诱变剂浓度处理时间（min18诱变剂使用续1氮芥（液状物）0.1~1mg/ml密闭反应5~10甘氨酸或大量稀释烷化剂，引起染色体畸变与NaHCO3作用即释放N–芥子气糜烂性毒气，小心操作乙烯亚胺（液体）1:100~1:100028℃或低温处理30~60稀释烷化剂，高浓度效果较好有剧毒，易燃，可在4℃冰箱小心操作，避光保存盐酸羟胺（液体）0.1~5%数小时或生长过程中诱变稀释与胞嘧啶作用产生转换，引起CG→AT突变有损健康，注意安全操作氯化锂（白色粉末）0.3~0.5%加入培养基中，在生长过程中诱变稀释需与紫外线、亚硝酸、硫酸二乙酯等复合处理才有效易溶于水，易潮解5-溴鸟嘧啶（白色粉末）20~30mg/ml与孢子悬浮液混合振荡培养，处理一定时间后，稀释涂皿稀释有机体缺乏胸腺嘧啶时较易掺入DNA中引起突变，能诱发正突变与回复突变碱基类似物诱变剂使用续1氮芥（液状物）0.1~1mg/ml密闭反应5~19微生物原生质体融合方法微生物放线菌（链霉菌）G+细菌（杆菌）霉菌（顶头孢霉）菌体准备液体培养基中加0.3%~1%甘氨酸液体培养基加0.5mol/L蔗糖0.2g湿菌体在含有0.01mol/LDTT的柠檬酸－磷酸盐buffer中预处理60min稳定剂Pbuffer※SMMADbuffer※※0.7mol/LNaCl酶及浓度溶菌酶1mg/ml，30℃，15~60min溶菌酶100mg/ml，42℃，30分钟5mg/mlNovozyme、0.5%蜗牛酶＋1%纤维素酶，28℃，180min融合剂65%PEG（分子量4000）0.5~1min40%PEG（分子量6000）2min30%PEG（分子量6000），0.01mol/LCaCl2溶液＋0.05mol/L甘氨酸（pH=7.5）30℃，10min微生物原生质体融合方法微生物放线菌G+细菌霉菌菌体准备液体培20

原生质体融合-原生质体融合-21原生质体制备：（1）

根据材料选择破壁酶

细菌：溶菌酶

真菌:Zymolyase-20T，5000T，Novozyme234，蜗牛酶，纤维素酶，

溶壁酶，崩溃酶，

几丁质酶等（2）

缓冲液（3）酶解条件

温度、时间、酶成分配比等原生质体制备：（1）根据材料选择破壁酶22融合电融合技术：

原生质体在电场中，由于加直流脉冲，膜被击穿，导致融合的发生。特点：

空间定向，时间同步，显微镜监视化学因子诱导融合：

聚乙二醇（polyetheneglycol,PEG）Ca2+

、Mg2+

等阳离子pH融合电融合技术：23再生

恢复细胞原貌，能够再生长

高渗培养基

蔗糖

（0.6M）

山梨醇(1.0M)

氯化钠(0.7M)再生恢复细胞原貌，能够再生长24基因工程一、概念

基因工程是指在基因水平上的遗传工程，即用人工方法将所需要的某一供体生物的遗传物质－DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，以让外来的遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。所以基因工种是人们在分子生物学理论指导下的一种自觉的能象工程一样可事先设计和控制的育种新技术，是人工的离体的分子水平上的一种遗传重组技术，是一种可完全超远缘杂交的育种新技术，因而是一种最新、最有前途的定向育种新技术。基因工程一、概念25二、主要操作过程

（一）基因分离

1、分别提取供体细胞（各种生物都可选用）的DNA与作为载体的松驰型细菌质粒（也可用噬菌体或病毒作载体）。2、根据“工程蓝图”的要求，在供体DNA中加入专一性很强的限制性核酸内切酶，从而获得带有特定基因并露出粘性末端的DNA单链部分（必须时可人工合成粘性末端）。二、主要操作过程（一）基因分离26（二）体外重组

把供体细胞DNA片段与质粒DNA片段放在试管中，在较低的温度（56℃）下混合“退火”。由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸组成，所以当两者混在一起时，凡粘接末端上碱基互补片段就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双链，这时在外加的连接酶作用下，供体的DNA与质粒DNA片段相连，形成了一个完整复制能力的环状重组体“杂种质粒”。

（二）体外重组把供体细胞DNA片段与质粒D27（三）重组载体导入受体细胞内（四）复制、表达

这种杂种质粒进入受体细胞后，通过自我复制而扩增，并使受体细胞表达为供体细胞所固有的部分遗传性状，这种受体菌，即成为“工程菌”。

（三）重组载体导入受体细胞内（四）复制、表达28（五）筛选、繁殖

质粒，或所带DNA能表达产生一定产物，可通过一选择性培养基或试剂鉴别出来。

原来100000g胰脏仅能提取3－4g胰岛素，而用工程菌发酵生产，只要几升发酵液便可取得同样数量的产品。（五）筛选、繁殖质粒，或所带DNA能表达产29分子育种容错PCRDNAshuffling分子育种容错PCR30容错PCR（Error-pronePolymeraseChainReaction,ep-PCR）Taq聚合酶是从一株耐热细菌Thermusaquaticus中分离获得，由于它缺乏3’－5’的校正活性，因此在PCR过程中会插入一些错误的碱基。在通常情况下，发生错误碱基插入的频率为0.1～2x10-4。通过改变PCR的一些反应条件，可以增加这种错误碱基插入的频率，从而可用来实现基因的定向进化。容错PCR（Error-pronePolymeraseC31在PCR系统中可用于增加碱基错误插入频率的方法增加MgCl2浓度；加入一定浓度的MnCl2；在PCR中采