化学发光免疫检验技术（免疫学检验课件）

第二十一章

化学发光免疫技术本章要点化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。1化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型。2化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技术。3电化学发光免疫分析基本原理。4化学发光免疫技术的临床应用。5CONTENTS目录发光基本知识化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析电化学发光免疫分析化学发光免疫技术的临床应用0102030405前言化学发光免疫技术是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的抗原抗体反应技术相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、维生素和药物等的检测分析技术。该技术具有特异性高、灵敏度高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化分析等特点，在免疫学检验中应用广泛。前言放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术金免疫技术化学发光免疫技术标记免疫技术发光基本知识01发光基本知识发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态，释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激发能不同可将发光分为光照发光、生物发光和化学发光。一、发光发光基本知识（一）光照发光（photoluminescence）发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。发光基本知识（二）生物发光（bioluminescence）发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP产能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。荧火虫荧光素氧化荧火虫荧光素荧光素酶光发光基本知识（三）化学发光（chemiluminescence）某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。发光基本知识一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：该反应必须提供足够的激发能,并由某一步骤单独提供,因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光。要有有利的反应过程,使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子,或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。123发光基本知识二、化学发光剂在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物。作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下几个条件：发光的量子产率高。物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配。能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物。其化学发光常是氧化反应的结果。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。发光基本知识常用的化学发光剂或发光底物有：直接化学发光剂酶促反应的发光底物电化学发光剂二、化学发光剂发光基本知识（一）直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。如常用的吖啶酯（acridinium，AE）。发光基本知识吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。发光基本知识（二）酶促反应的发光底物是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。HRP的常用的发光底物为鲁米诺或其衍生物，ALP的发光底物为金刚烷（AMPPD）。发光基本知识（1）鲁米诺或其衍生物

鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的光。鲁米诺激发态二价阴离子氨基酞酸盐光荧光激发光强度发光基本知识鲁米诺增强发光反应原理发光基本知识（2）AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕碱性磷酸酶金刚烷酚盐光AMPPD发光反应原理发光基本知识（三）电化学发光剂电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。化学发光免疫分析02化学发光免疫分析一、检测原理用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)和磁颗粒性的抗体（抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原(抗体)的含量。化学发光免疫分析化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图化学发光免疫分析二、方法类型分离方法常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过在磁场中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物进行分离的技术。1化学发光免疫分析二、方法类型常用的免疫学反应模式双抗体夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法2化学发光免疫分析三、技术要点抗原抗体结合反应结合物与游离物的分离(磁颗粒分离技术)抗原抗体结合反应化学发光酶免疫分析03化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗体(抗原)发生免疫反应后，经洗涤将结合物与游离的酶标物分离后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。一、检测原理化学发光酶免疫分析碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图洗涤清除抗体包被的磁珠抗原碱性磷酸酶标记抗体双抗体夹心复合物双抗体夹心复合物AMPPDAMPPD发光化学发光酶免疫分析二、方法类型根据标记酶不同分类可分为辣根过氧化物酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标记的化学发光酶免疫分析。前者常以鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常以AMPPD作为发光底物。1化学发光酶免疫分析二、方法类型根据免疫学反应模式分类同化学发光免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法等主要模式，所不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而不是直接标记发光剂。2化学发光酶免疫分析三、技术要点抗原抗体结合反应结合物与游离物的分离(磁颗粒分离法、微粒子捕获法、包被聚苯乙烯反应珠或孔分离法)酶促发光反应电化学发光免疫分析04电化学发光免疫分析一、检测原理电化学发光免疫分析（ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，通过抗原抗体反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定量分析，它包括电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图抗体包被的磁珠抗原RU(bpy)32+标记抗体引入TPA缓冲液TPA电子供体RU(bpy)32+发光电化学发光免疫分析电化学发光免疫测定示意图抗原抗体结合的磁性微粒光电倍增管电极电极流动测量池液体流向磁铁激发区工作电极未结合标记抗体电化学发光免疫分析二、方法类型分离方法：常用磁颗粒分离技术。免疫学反应模式：其反应模式同发光免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不同只是相应抗原或抗体上标记的是三联吡啶钌。12电化学发光免疫分析三、技术要点抗原抗体反应结合物与游离物的分离(磁颗粒分离技术)电化学发光过程化学发光免疫技术的临床应用05化学发光免疫技术的临床应用一、化学发光免疫技术的特点敏感度高，甚至超过RIA；精密度和准确性均可与RIA相比；试剂稳定，无毒害；测定耗时短；测定项目多；已发展成自动化测定系统。123456化学发光免疫技术的临床应用二、化学发光免疫技术常见的检测项目甲状腺激素：T3、T4、hTSH、FT4、FT3、抗TPO、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。生殖激素：β-HCG、催乳素、促卵泡激素、促黄体激素、孕酮、雌二醇、非结合雌三醇、甲胎蛋白、睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。肾上腺/垂体激素：皮质醇、尿皮质醇、人生长激素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。123化学发光免疫技术的临床应用二、化学发光免疫技术常见的检测项目贫血因子：维生素B12、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋白等。肿瘤标记物：AFP、CEA、PSA、游离PSA、CAl9-9、CAl25、CAl5-3等。感染性疾病：衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原体抗原确认、弓形体IgG抗体、弓形体IgM抗体、风疹病毒IgG抗体、风疹病毒IgM抗体、巨细胞病毒IgG抗体、巨细胞病毒IgM抗体等。456化学发光免疫技术的临床应用二、化学发光免疫技术常见的检测项目糖尿病：胰岛素、C肽等。心血管系统：肌酸激酶MB同工酶、地高辛、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白-I等。病毒标记物：HIVl/2Ab、HBsAg、HBsAg确认、HBsAb、HCVAb、HAV、IgM、HAVAb、HBcAb、HBclgM、HBeAg、HBeAb等。789