五分类血球仪的应用介绍与进展2课件

血细胞分析仪的介绍江苏省中医院葛亮血细胞分析仪50年的发展历史

1590年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最原始的显微镜（图1），1610年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大，后来被列文霍克改进成为原始的显微镜。1658年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞，他是第一个见到红细胞的人，开始进行红细胞计数则是200年后的事情了。而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100年。自从发明了显微镜以后，人们从微观世界中了解和观察到了血液的组成，并根据他们的特点分别将它们称为红细胞和白细胞和血小板。在以后的研究中，人们发现许多疾病的发生和发展与血液中的细胞数量之间存在一定的关系。依据对疾病诊断的需求，人们开始寻求对血液中细胞的数量进行计数。1852年就有人开始设计对红细胞的计数办法，1855年发明了用于计数血细胞的计数板，

目前仍然使用的改良Neubauer计数板就是应用最为广泛和持续时间最为长久的经典一种，虽然各种类型的血细胞计数仪已在广泛使用，但血细胞计数板法仍然是最为可靠和最为经典的计数技术，它不仅适用于血细胞计数，

还可用于其他细胞、动物血细胞、微小粒子及需要在显微镜下计数的各种样品，因此计数板仍然是检验工作者应该掌握的基本技能，是不应该忘记和放弃的手段。

最初的血细胞计数仪是一种单参数测定仪器，只能对血液中的红细胞和白细胞进行计数，并且需人工切换。最早生产的血球计数仪为Coulter型

1958年以Coulter命名的专门从事颗粒性测量计数的仪器公司，库尔特电子（Coulterlectronics

）公司成立。

库尔特原理计数原理是根据血细胞的不良导电性和产生电阻抗原理来计数血液中的细胞，也就是电阻式血细胞计数原理，这种原理现在已经成为血细胞计数和分析中最为经典的原理。现在，95%的血细胞分析仪采用库尔特原理

库尔特原理三要素：小孔、负压、电极

检测：细胞大小和数量

负压血细胞悬液外电极内电极小孔小孔管小孔电流样品杯小孔近观在等渗电解质溶液（稀释液）中，有一个用于细胞计数的小孔管，其内侧充满了稀释液，并有一个内电极，其外侧细胞悬液中有个外电极，小孔两侧的电极之间有稳定的电流。细胞为相对不良导体，其导电性质比稀释液低，当有个细胞通过小孔，于瞬间引起了电压变化而出现脉冲信号，脉冲的数量与细胞的数量成正比，高度与细胞体积成正比。脉冲信号经放大，阈值调节，甄别，整形后，送入计数系统进行处理，得出被测细胞的数量和体积分布直方图。检测区域红细胞红细胞通过小孔库尔特原理Oscilloscope示波镜检测区域白细胞白细胞通过小孔库尔特原理示波镜此后，欧洲、日本也开始了血液细胞计数仪的开发和研制,我国在60年代中期也开始了这种仪器的开发和生产。例如日本Sysmex公司1962年就生产了可进行红细胞和白细胞计数的CC-1001型血球计数仪，我国1965年在上海也生产了简单的血细胞计数仪，1975年北京医疗仪器厂也开始模仿设计自己的简单的红白细胞计数仪。到目前为止已经有许多国家开始生产各种类型的血细胞分析仪，经过半个多世纪的发展，这种仪器已经有了非常明显的进步。以前因为只能进行细胞计数，因此我们一般将这类仪器叫做血细胞计数仪（BloodCellCounter）,由于技术的进步目前这类仪器可以提供除了血细胞计数以外的更多参数的联合测定和分析，因此我们一般将这类仪器统称为血液细胞分析仪(HematologyAnalyzer)。血细胞分析仪的技术进步1、稀释技术的进步2、分析参数的增加3、血小板计数功能的增加4、自动取样技术5、仪器的清洗技术6、小孔管技术的改进其他计数原理的血细胞分析仪

1.激光法：应用单束激光照射到经过鞘流技术处理的排列成一列的单个细胞上，根据细胞阻断激光束的频率以及PMT收集到的激光折射信号，对细胞的数量、体积进行分析的仪器。

其他计数原理的血细胞分析仪2.离心式血液分析仪：将血液充入到含义特殊试剂的毛细管内，在专用离心机上离心，根据血细胞中各种成份的比重不同而分布在不同的细胞层内的原理，血细胞被吖啶橙染色，各细胞层会有明显的颜色差异，然后将毛细管放在特殊的判读机上对不同的细胞层进行定量分析.3.移动光学法：早期的光学法血细胞计数仪器，采用普通光源，血细胞在移动过程中被检测到，不能分析细胞的大小和内部结结构，因此仅可进行红细胞和白细胞的计数

库尔特技术高频度分析-直方图直方图-X轴：体积（fL）-Y轴：相对数量通道划分RBC直方图：36-360fLPLT直方图：2-20fLWBC直方图：35-450fL脉冲编辑（专利技术）作用：删除不规则脉冲对体积测量的影响。重叠校正（专利技术）

小孔近观

作用：纠正因重叠而导致的对颗粒计数和体积测量的影响。三次计数/延长计数血小板计数以三次拟合的均值为依据；对血小板浓度小于67X109/L的标本，仪器自动延长1-2个三次计数。三次计数：统计补偿；监控计数过程的稳定性。延长计数：针对低浓度的标本。扫流技术(专利技术)测试区域红细胞回流示波镜红细胞血小板+-测试区域红细胞被扫流液冲走示波镜RBCPLT+-扫流液扫流技术(专利技术)扫流技术(专利技术)作用：防止红细胞回流对血小板计数的干扰；防止细胞再度进入感应区被两次计数。拟合曲线（专利技术）在血小板的直方图上可见两条曲线：一条是2fl-20fl的原始数据曲线;另一条是0fl-70fl的拟合曲线.由最小平方回归法定义出一条对数正态曲线，即拟合曲线；拟合曲线血小板计数的干扰主要来自:2fl以下：噪音;细菌的干扰20fl以上：裂红细胞;小红细胞;白细胞的干扰拟合曲线的作用对曲线下的面积进行积分计算；将该面积值校准到参考的PLT计数；获得与参考方法最具相关性的血小板数值.在0-70fL范围的非血小板脉冲被拟合曲线排除于血小板计数之外；大大增加了血小板的线性范围(0-1,500,000)从三分群到五分类三分群：小细胞单个核细胞粒细胞五分类：淋巴细胞单核细胞中性粒细胞嗜酸细胞嗜碱细胞LymphocyteMonocyteGranulocyte小细胞单个核细胞粒细胞淋巴嗜碱单核嗜酸中性粒细胞白细胞三分群法原理

各种单纯电阻法血细胞分析仪的白细胞三分群法原理是根据白细胞体积分布直方图进行分析和计算得到的。经过特殊溶血剂处理的白细胞，可将特定的细胞群进行处理，使得绝大多数淋巴细胞体积缩小，使得中性粒细胞体积适当增大。因此在白细胞分布直方图上出现两个明显的细胞分布峰。左侧体积较小的一群细胞称为淋巴细胞群（LYM），右侧体积较大的称为粒细胞群（GRAN），位于两者之间的称为中间细胞群（MID），中间细胞群一般指含有嗜酸粒细胞，嗜碱粒细胞和单核细胞的细胞群。白细胞五分类法原理

进入90年代中期以来，国外许多厂家已经不满足于三分类型的血细胞分析仪，逐步开始研制和推出具有五分类或更多项白细胞分析技术的全自动型血液分析仪器，比较著名的厂家有：Coulter、Sysmex

、ABBOTT、Bayer、ABX等。各厂家使用的白细胞分类技术多样化，

复杂化，使得白细胞分类技术更加成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品（试剂）价格的增加。

五分类VCS技术运用V、C、S三种探针,在流式通道的某一位点,对通过的单列白细胞，进行逐个的、同时的、三重的检测，以及三维分析,以确定其亚群性质。V-低频波，分析细胞体积；C-高频波，分析细胞核型；S-激光，分析细胞的颗粒特性。接近原态的WBC分析接近原态的白细胞进入流式通道VCS检测八千多个白细胞逐个、直接、同时地在流式通道内接受VCS三重检测，得到各自的三维座标值VCS更好的大小测量方法

0-3

(相对大小)V是以参考的直流电阻方法检测整个细胞的体积普通流式方法根据激光的前向散射估计细胞的相对大小激光VCS

-DC更好的内部结构测量方法

7-10(复杂性)RF运用类似于超声波的高频波测量细胞的内部结构普通流式方法根据激光的低角度散射估计细胞的复杂性激光VCS-RF射频(RF)信号的问题细胞越大，它发出射频信号所需要的时间就越长；因此，细胞大小对射频信号具有影响；这种影响可以减弱对LY、MO、和GR的分辨效果。VolumeRF将射频转换为阻光性已知细胞体积，可对射频信号作体积补偿；使信号的变化只受细胞内部结构的影响；阻光性测量核的密度和分叶性，使更好地区分细胞。VolumeOpacity高频传导信号大的细胞嗜中性、嗜酸性、嗜碱性粒细胞高频传导信号小的细胞淋巴、单核细胞高频传导（阻光性）9Odeg.激光VCS-LaserS是运用一个宽角度的散射范围（10-70）来测量细胞的颗粒特性普通流式方法运用单角度/側向激光散射测量细胞的颗粒特性更好的颗粒特性测量方法激光散射信号大的细胞嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞激光散射信号小的细胞淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞激光散射三维分析技术将检测过的8,192个细胞分布到一个以V、C、S为三维坐标的空间内，显示出细胞群特征。高智能的计算机软件分析分析细胞群的位置、相对密度、轮廓、和大小。三维坐标的数据分析位点多过

16×106个。三维空间的立体表示VCS三维分析的技术特点接近原态的白细胞分析一个分类试剂包

ScatterPak双试剂系统的作用去红细胞:红细胞溶解剂通过渗透压差溶解红细胞；保持白细胞原态:溶解终止液令白细胞恢复到“接近原态”大小。十余种异常细胞的报警提示12345678910细胞化学技术：核酸荧光染色区别于酸碱染色、酶染色、糖原染色核酸染色物质（荧光物质）Polymethine

（聚次甲基）Oxazine(口恶嗪）不同的细胞亚群、不同的成熟阶段，其核酸的含量，核酸的结构，DNA/RNA的比例不同，表现不同的着色性。与半导体激光有很好的适配性，633nm激发荧光核心技术半导体激光流式细胞术加核酸荧光染色电阻抗加射频双鞘流技术流式通道和光路系统半导体激光器

(=633nm)双色分光镜光电倍增管（荧光信号）流动室光电倍增管（侧向散射光信号）光电二极管（前向散射光信号）核酸染色和信号分析激光束

(=633nm)侧向荧光：DNA/RNA信息侧向散射光：细胞内结构信息前向散射光：细胞体积信息半导体激光提供的细胞信息前向散射光(FSC)：反映细胞大小。侧向散射光(SSC)：反映细胞的内容物如核和颗粒。侧向荧光(SFL)：反映细胞内DNA、RNA的含量。采用阻抗、激光散射和荧光染色技术

直流电阻抗法（DC）用于测量细胞体积大小。激光散射产生的前向散射光、侧向散射光和侧向荧光可用于探测测白细胞体积大小、细胞内含物的情况(细胞核以及颗粒情况)，侧向荧光则可以反应细胞内托样核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的含量，特有的嗜酸性粒细胞检测溶血剂Strmatolyzer-EO可将除了嗜酸细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整嗜酸细胞的液体通过小孔可以按照电阻法计数技术进行计数。在嗜碱细胞通道中，使用特殊溶血剂Strmatolyzer-BA可将除了嗜碱细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整嗜碱细胞的液体通过小孔可以按照电阻法计数技术进行计数。

检测原理1，Stromatolyser-4DL试剂中的表面活性剂可溶解和破坏红细胞和血小板，并在白细胞膜上打孔。2，Stromatolyser-4DS试剂中的聚次甲基染料可进入被打孔的白细胞，与核酸和细胞器结合，经波长633nm的激光照射，所产生的荧光强度SFL与细胞核酸含量成一定比例。3，Stromatolyser-4DL中的有机酸能与嗜酸性颗粒特异结合，根据侧向散射光信号强度SSL，能提高嗜酸性粒细胞从中性粒细胞内区分出来的能力。。WBC分类散点图上的报警区域

FluorescenceSideScatterBlasts/AtypicalLymphImmatureGranMonoLymphEOLeftShiftNeutNRBC2.

WBC/Baso

检测通道

检测参数

WBC

Basophil检测原理FBA

试剂可引起除嗜碱性粒细胞之外的白细胞（裸核），红细胞（影红细胞）以及血小板（影血小板）溶解和皱缩。根据前向散射光FSC和测向散射光强度SSC，使嗜碱性粒细胞和其它细胞因容积差异而区分。BASO

试剂作用示意图BASOotherWBCRBC溶血(酸性,低渗溶血素)WBC/BASO检测：试剂反应前后细胞形态的变化WBC/BASO-散点图SideScatter(Internalstructure)ForwardScatter(Volume)BASOWBC3.

RET

检测通道

检测参数：RETIRFLFRMFRHFR检测原理RETSEARCH-II-DYE

试剂中的碱性槐黄O能使RET中的RNA染色，根据前向散射光FSC和侧向荧光信号SFL，把网织红细胞从无核的成熟红细胞和有核的白细胞中区分出来。RET试剂作用示意图染色:Ploymethine:RNAOxazine:DNARETWBCRBC高荧光信号很低荧光信号非常强的荧光信号Fluorescence(RNA)RET-散点图ForwardScatter(Volume)MFRHFRLFRPLTRBC-ORETWBCIRF网织红细胞散点图IRF：未成熟网织红细胞比率有效监控红细胞生成动力学骨髓抑制红细胞生成恢复期血疗效的观察体积荧光ABXPentra系列五分类血细胞分析仪

ABXPentra系列全自动五分类血细胞分析仪，采用了白细胞计数通道，双鞘流检测通道(LMNE散点图)和白细胞/嗜碱细胞（WBC/BAOS）通道同时进行检测来完成白细胞五分类的全面分析。LMNE检测通道采用三种技术原理同时进行白细胞的分类：1、双鞘流原理（DHSS）2、细胞化学染色（Cytochemistry）结合吸光法原理3、鞘流阻抗技术（FocusedFlowImpendance）。白细胞/嗜碱细胞检测通道：采用生物溶解技术，阻抗技术，域值界标技术进行白细胞计数及嗜碱细胞的检测。ABXPentra系列ABX采用了先进的DHSS专利检测技术，在分析五分类的同时能够检测两群异常白细胞亚群：①巨大未成熟细胞（LIC）百分比及绝对值②异型淋巴细胞（ALY）百分比及绝对值。ABX先进的白细胞分类原理能够满足临床对异常细胞群的较高检测灵敏度，能够提供82种不同的报警信息及提示信息，形成了一套非常完整的白细胞分类的报警系统。

其它白细胞分类的原理1.激光散射和细胞化学染色技术：仪器在白细胞分类上采用了白细胞过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。根据细胞化学染色的特性进行白细胞分类。早期的原始粒细胞为阴性，原始粒细胞以下各阶段都含有过氧化物酶，并随着细胞的成熟而增强。不同的粒细胞过氧化物酶含量不同，嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶，中性粒细胞含有较强的过氧化物酶，嗜碱粒细胞不含此酶。单核细胞除早期原始阶段外，均含有较弱的过氧化物酶。淋巴细胞不含过氧化物酶。根据激光法散射光强度进行的细胞体积的测量同时也获得了细胞大小的信息，在白细胞过氧化物酶散点图上，X轴表现过氧化物酶强度，过氧化物酶强阳性细胞位于右端；Y轴表现散射光强度信号，位于上方的表示散射光信号强，细胞体积大。除了嗜碱细胞外每个类型的细胞根据它们的特点被记录于特定的位置，在设定的门的范围内形成分类。其它白细胞分类的原理2.多角度偏振光散射法应用于白细胞五分类（MAPSS技术）：

该技术的基本原理是标本在水动力聚焦系统的作用下进入检测部，在激光束的照射下，细胞在多个角度都产生散射光。仪器特别设置了四个角度来收集散射光的信号。0度为前角光散射，

用于粗略判断细胞体积大小；10度为狭角散射，

用于检测细胞结构及其内部复杂性的指标；90度为垂直光散射，用于对细胞内部颗粒及细胞核分叶情况的分析；90度偏振光散射，基于颗粒可以将垂直角度的激光消偏振的特性，将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其他细胞中分离出来。根据散射光的角度和位置，仪器内部的四个检测器可以接收到相应的信号，由仪器内部的微处理器进行分析处理，不同的细胞将被安置在散点图上的相应位置，根据计算将结果白细胞分类结果得到

血细胞分析仪的发展近况和展望

1、血常规检验多参数化

2、多功能合成扩展

3、检测速度的提高

4、方法的改进和进展

5、应用的方便性

1.嗜酸细胞增多症嗜酸细胞增多症结果特征白细胞分类散点图上分类良好，各细胞亚群清晰嗜酸细胞亚群细胞增多2.传染性单核细胞增多症传染性单核细胞增多症结果特征白细胞分类散点图上淋巴细胞区域细胞较多，一部分位于异型淋巴细胞区域涂片可见较多异型淋巴细胞手工涂片结果为：中性粒细胞14%

淋巴细胞59%

单核细胞3%

嗜酸细胞4%

嗜碱细胞2%

异型淋巴细胞18%3.缺铁性贫血缺铁性贫血结果特征病人接受过输血红细胞直方图左移并出现双峰，右侧峰为输入的正常细胞峰；左侧为小红细胞峰，且左端上抬血小板直方图受小红细胞影响在20fl处上扬4.巨幼红细胞性贫血巨幼红细胞性贫血

结果特征此病人由维生素B12缺乏引起红细胞直方图右移，提示红细胞较大RDW增高，提示红细胞大小不一白细胞分类散点图下方出现较多红细胞碎片涂片可见红细胞大小不一、大红细胞及畸形红细胞5.镰形红细胞贫血镰形红细胞贫血结果特征白细胞分类散点图下方出现大量未溶解镰形红细胞由于未溶解的镰形红细胞参与白细胞分类，导致PC2报警镰形红细胞影响白细胞在35fl处的计数，触发*R报警6.疟原虫疟原虫结果特征疟原虫细胞影响白细胞在35fl处的计数，触发*R的报警白细胞散点图下方出现疟原虫细胞群7.红细胞未溶解红细胞未溶解的结果特征未溶解的红细胞影响白细胞在35fl处的计数，触发*R报警白细胞分类散点图下方出现大量未溶解红细胞8.红细胞碎片红细胞碎片的结果特征红细胞直方图左侧出现一个小峰，系由红细胞碎片引起碎片参与白细胞分类，导致PC2报警，在分类散点图下方出现大量红细胞碎片碎片影响血小板计数，血小板直方图在20fl处上扬9.冷凝集冷凝集的结果特征MCH结果为40.4，MCHC结果为396，提示怀疑冷凝集由于红细胞发生凝集导致红细胞数量降低，MCV增高10.冷凝集(温育后)冷凝集(温育后)结果特征温育后红细胞数量恢复正常MCV、MCH、MCHC都恢复正常白细胞计数和分类前后无影响11.大血小板大血小板的结果特征MPV增高提示血小板体积增大在白细胞散点图下方出现大血小板12.小血小板小血小板的结果特征MPV降低提示血小板体积偏小直方图上血小板呈现非正态分布，曲线不拟合，出现R报警13.急性粒细胞性白血病急性粒细胞性白血病结果特征中性粒细胞区域上方出现大