中药比较药代动力学研究思路与应用(宋敏)课件

中药比较药代动力学研究思路与应用宋敏 博士副教授药物分析教研室中国药科大学1中药研究现状中药研究热点：质量控制、药效物质基础 质量控制：DNA分子标记技术建立部分动物药的鉴别方法采用生物自显影技术、细胞膜技术、生物活性测定等生物方法建立药材的定性鉴别和定量分析方法采用“一标多测”技术建立多成分含量测定方法；采用指纹图谱分析法建立部分药材的整体质量控制方法--逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡

2中药药代动力学∈药效物质基础研究目前，研究手段大多与化学药物相类似，针对已知活性成分单体进行研究，但单味中药即是一个化学分子库，且有效成分不甚明确，相互间可能存在的影响关系不明确。thekavaextractincreasedtheoralbioavailabilityofkawaininratwhichwasalsothemaincauseoftheadversedrugreactionPharmacokineticsanddispositionofthekavalactone

kawain:interactionwithkavaextractandkavalactonesinvivoandinvitro.Drug.Metab.Dispos.2005,33,1555–1563.中药药代动力学研究现状3中药药代动力学∈药效物质基础研究中药中化学成分存在相互影响ThecoexistingingredientsinGentiana

manshuricahadremarkableinfluenceonthepharmacokineticsofgentiopicrinStudiesonpharmacokineticsofgentiopicrininlongdananditscompoundpreparationinrats.Chin.Pharm.J.2003,40,212–215.中药药代动力学研究现状4中药药代动力学有效成份单体与其在中药提取物中的体内过程并不一致，势必在药理作用上得以体现SuchasdihydrotanshinoneandcryptotanshinonewerelessactiveinacetylcholinesteraseinhibitorywhenisolatedRen,Y.H.,Peter,J.H.,Robert,C.H.,Melanie-Jayne,R.H.,2004.Novelditerpenoid

acetylcholinesteraseinhibitorsfromSalviamiltiorrhiza.PlantaMed.2004,70,201–204.5中药药代动力学药理作用差异salvinolicacidB,whichisthemainhydrophiliccomponentinS.miltiorrhiza

Bge.,showedlowereffectiveconcentrationininvitroangiogenesisstudythanthecrudeextract

Crude

extractofSalviamiltiorrhizaandsalvianolicacidBenhancein

vitroangiogenesisinmurineSVRendothelialcellline.Planta

Med.2003,69,26-32中草药间的相互配伍反应及与其他药物的相互作用日益得到重视，但仍需进一步研究6 挖掘丹参药材中共存组份之间可能存在的相互影响情况，认识丹参药效物质基础，为临床用药提供指导，为新药开发提供理论依据。第一部分

丹参提取物有效成分比较药代动力学7第一部分

丹参提取物有效成分比较药代动力学丹参水溶性成分丹参酯溶性成分8丹参水溶性成分:丹酚酸B和原儿茶醛 丹酚酸B：丹参水溶性成分中含量最高和药典规定的含量测定指标成分。 原儿茶醛：丹酚酸B在体外可能的降解产物。9实验条件ThermoFinniganSurveyorLC-TSQQuantumUltraAM液相色谱串联四极质谱系统(美国菲尼根质谱公司)。色谱柱：Waters-C18250mm4.6mm,5m (预柱为C18,10mm4.6mm,5m)；流动相：甲醇(A)－1％冰乙酸(B)为流动相， 梯度洗脱：0min(40％A)-4min(40％A)-4.1min(80％A)-10min(80％A)；流速：1.0mL·min-1，柱后分流，0.3mL·min-1进入质谱检测器；进样量：20l。一、原儿茶醛的药动学研究10质谱图Massspectraofprotocatechualdehyde(A)andinternalguaiacol(B)AB11A:BlankplasmaB:Protocatechualdehydeaddedtoblankplasma,Cprotocatechualdehyde=200.0ng·ml-1(tR=4.90min)C:Ratplasmasampletaken20minafterigofprotocatechualdehyde,Cprotocatechualdehyde=1002.7ng·ml-1(tR=4.89min)ABC12药动学试验设计Sprague-Dawley大鼠6只，雌雄各半，体重250±10g，由南京医科大学动物实验中心提供。大鼠于受试的前晚起禁食，不禁水，于灌药4小时后给食。大鼠灌胃给药原儿茶醛62mg·kg-1。分别于给药后2、5、10、15、20、30、40min和1.0、1.5、2.0、3.0h从眼底静脉丛取血0.5mL，置肝素钠抗凝处理过的试管中，3000r·min-1离心10min，转移血浆，置-20℃保存待测。13原儿茶醛药－时曲线Meanplasmaconcentration-timecurveafterig

protocatechualdehyde62mg·kg-1inrat达峰时间在10～15min，而后以极快的速度消除，180min后只能测到少数大鼠的血药浓度。14色谱条件与质谱条件质谱条件 丹酚酸B是三分子丹参素和一分子咖啡酸的缩合物，虽然在负离子监测模式下也可生成m/z717的[M-H]-，继而经二级碰撞脱去一分子丹参素产生子离子m/z519[M-198-H]-，但在相同的碰撞能量下也可生成脱去两分子丹参素的子离子m/z321，两者丰度相差不大，不够稳定如图所示；相比较正离子监测模式下[M+Na]＋峰m/z741较稳定，且其子离子m/z561为脱去一分子咖啡酸后生成，丰度较强，因此被选用。ABNegativemode; B.Positivemode二、丹酚酸B的药动学研究15丹酚酸B在大鼠体内的药－时曲线Meanplasmaconcentration-timecurveofsalvianolicacidBafterig.salvianolicacidB260mg·kg-1inrat16三、丹参水溶性提取物的中

丹酚酸B和原儿茶醛的药动学灌胃试液的配制：取丹参干燥药材粉末500g，水1000mL提取三次，每次1hour，过滤后滤液浓缩，再分别用60%,85%和95%的乙醇沉淀鞣质，过滤，滤液减压浓缩至干，用适量生理盐水溶液即得，HPLC-UV测定其中丹酚酸B含量为26mg/mL，原儿茶醛为6.2mg/mL。17血药浓度经时过程 大鼠灌胃给药丹参水提物（其中相当于丹酚酸B260mg·kg-1和原儿茶醛62mg·kg-1）后的丹酚酸B和原儿茶醛的药－时曲线。Meanplasmaconcentration-timeprofilesofsalvianolicacidBandprotocatechualdehydeinratafterigofDanshenwatersolubleextract18小结与讨论原儿茶醛：大鼠灌胃给药原儿茶醛单体后的AUC为64754.0ng/ml·min，而灌胃给药含有相同含量原儿茶醛的丹参水提物后，其AUC只有25067.9ng/ml·min，即单体给药的AUC为提取物给药的2.6倍，Cmax为5.1倍，MRT为0.4倍，可见原儿茶醛单体给药时吸收较好，而消除快；以提取物方式给药后的原儿茶醛呈一房室模型，即只在中央室少量吸收，未向周边室分布就开始消除。Comparisonoftheplasmaconcentration-timeprofilesofprotocatechualdehyde

19小结与讨论丹酚酸B：以提取物方式给药后的丹酚酸B的AUC为98904.3ng/ml·min，是单体方式给药后的AUC(为22569.4ng/ml·min)的4.4倍，Cmax为3.4倍，MRT为1.5倍，即提取物方式给药使丹酚酸B的吸收变好了，消除减慢了。可能的原因包括提取物中的并存成分促进了丹酚酸B的吸收并减缓其消除，或其它成分的代谢转化。Comparisonoftheplasmaconcentration-timeprofilesofsalvianolicacidB20小结 经过大鼠原儿茶醛和丹酚酸B的药动学比较研究可知，丹参药材水溶性提取物中的其他组份可直接影响原儿茶醛和丹酚酸B的吸收及消除，分别对它们产生抑制和促进作用。因此，利用中药中含有的“标志成分”的纯品（或标准品）进行药动学研究是必要的，这也是目前中药药动学研究的重要方法，可以提供较好的参考，但却不能以此代替中药材提取物或中药复方制剂（更复杂）的药动学研究。21丹参脂溶性成分的大鼠药代动力学研究 同时分析检测7个活性成分，获得其中5个成分的大鼠体内的经时过程Meanratio-timeprofileofseveralcompoundsinDanshenaceticetherextract22药代动力学试验设计

Sprague-Dawley大鼠18只，平分为3组，每组雌雄各半，体重250±10g，大鼠于受试的前晚起禁食，不禁水，于给药4小时后进食。3组大鼠分别灌胃给药丹参酮ⅡA单体8.0mg·kg-1

隐丹参酮单体5.7mg·kg-1丹参脂溶性提取物 （相当于分别含隐丹参酮、丹参酮ⅡA为5.7和8.0mg·kg-1） 分别于给药后5、10、15、20、30、40min和1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0h从眼底静脉丛取血0.5mL，置肝素钠抗凝处理过的试管中，3000r·min-1离心10min，转移血浆，置-20℃保存待测。23药代动力学结果-1Meanconcentration–timeprofilesofcryptotanshinoneinratplasmaafterintra-gavageofcryptotanshinone(5.7mg/kg)andtanshinonesextract(23.3mg/kg)(mean±S.D.,n=6).TheCmaxandAUCweresignificantlydifferent(P<0.001).24Meanconcentration–timeprofilesoftanshinoneIIAinratplasmaafterintra-gavageofcryptotanshinone(5.7mg/kg),tanshinoneIIA(8.0mg/kg)andtanshinonesextract(23.3mg/kg)(mean±S.D.,n=6).药代动力学结果-225结果分析与讨论1.灌胃丹参酮ⅡA

或隐丹参酮单体后丹参酮ⅡA

的药动学结果比较： 根据隐丹参酮的代谢物丹参酮ⅡATmax为25min可以发现，隐丹参酮在大鼠体内很快就发生脱氢反应被代谢丹参酮ⅡA，灌胃丹参酮ⅡA8mg/kg时AUC为499.37ng/ml·min还没有灌胃隐丹参酮5.7mg/kg时代谢产生的丹参酮ⅡA的AUC为560.68ng/ml·min高，说明丹参酮ⅡA的口服吸收很不好。 比较灌胃丹参酮ⅡA和灌胃隐丹参酮后丹参酮ⅡA的消除半衰期，经方差分析（P=0.46＞0.05）结果表明两者无明显差异。丹参酮ⅡA

隐丹参酮26结果分析与讨论2.灌胃隐丹参酮单体或丹参脂溶性提取物后隐丹参酮的药动学结果比较：cryptotanshinonecompartmentmodelCmaxTmaxt1/2AUC(Tn)ng/mLminminng/ml·minig.cryptotanshinoneOne9.7833.3172.662346.60ig.extractTwo51.4535.00464.928822.31P0.008＜0.050.734＞0.050.082＞0.050.027＜0.05灌胃丹参酮提取物后所测得的隐丹参酮的Cmax和AUC(Tn)分别提高了5.3倍和3.8倍。说明，丹参酮提取物中的其他成份可促进药效成份隐丹参酮的吸收从而对其药动学行为产生明显的影响。大鼠分别灌胃给予隐丹参酮单体和丹参酮提取物后，隐丹参酮的药－时曲线分别符合一、二房室模型，Tmax无差异。说明提取物中的其他成份对使隐丹参酮在大鼠体内的吸收速度加快，同时使其从中央室向周边室分布。

27tanshinoneⅡAcompartmentmodelCmaxTmaxt1/2βAUC(Tn)ng/mLminminng/ml·minig.cryptotanshinoneTwo3.5825.0331.22560.68ig.tanshinoneⅡATwo3.4019.2293.16499.37ig.extractTwo34.0438.3462.629257.19P0.003＜0.051.23E-6＜0.050.357＞0.050.004＜0.05结果分析与讨论3.灌胃丹参酮ⅡA单体或丹参脂溶性提取物后丹参酮ⅡA的药动学结果比较：灌胃丹参酮提取物后所测得的丹参酮ⅡA的Cmax和AUC(Tn)分别提高了10.0倍和18.5倍。说明，丹参酮提取物中的其他成份可促进药效成份丹参酮ⅡA的吸收、影响其代谢消除、或存在转化，从而对其药动学行为产生明显的影响。对于大鼠分别灌胃给予丹参酮ⅡA、隐丹参酮单体和丹参酮提取物后，丹参酮ⅡA的药动学参数比较可以发现，在丹参酮提取物中的其他组份可协同促进丹参酮ⅡA在大鼠体内的吸收的同时，隐丹参酮也脱氢反应代谢产生丹参酮ⅡA，两种作用的加合致使丹参酮提取物组丹参酮ⅡA的AUC为丹参酮ⅡA组的18.5倍，Tmax的显著性差异也说明这一点，与文献报道从十二指肠给药情况相一致。

28第一部分结论 丹参提取物比较药代动力学研究结果表明，中药材中的其他成分对其“标志成分”或“药效成分”的体内过程有较大的影响。 拮抗：原儿茶醛； 协同：丹酚酸B、丹参酮ⅡA及隐丹参酮； 促进转化：隐丹参酮代谢为丹参酮ⅡA。29第二部分

复方中药药代动力学有效成份单体与其在中药提取物中的体内过程并不一致，复方中药成分更加复杂，是否也存在相互作用someingredientsintheHuang–Lian–Jie–Du–TanghadpharmacokineticinteractionwithbaicalinandwogonosideComparativepharmacokineticsofbaicalinafteroraladministrationofpurebaicalin,RadixScutellariaeextractandHuang–Lian–Jie–Du–Tangtorats.J.Ethnopharmacol.2007,110,412–418.30第二部分

复方丹参制剂比较药代动力学

丹参和三七配伍后主要活性成分药代动力学相互作用，探讨它们的配伍机制31复方丹参方的药代动力学研究复方丹参方由丹参、三七和冰片三味药材组成。是活血化瘀的名方，广泛用于治疗冠心病、心肌梗塞、心绞痛、抗血栓等心血管疾病。来源于丹参的酚酸类成分和二萜醌类成分及来源于三七的皂苷类成分是复方丹参方中的主要药效物质。

32复方丹参方主要活性成分结构三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1酚酸类成分二萜醌类成分皂苷成分33受试灌胃混悬液的制备和含量测定丹参灌胃液： 丹参片30片，CMC-Na制备三七灌胃液： 三七片20片，同法制备丹参-三七配伍灌胃液： 丹参片30片+三七片20片，同法制备含量测定(mg·mL-1)丹参三七丹参-三七丹参素0.21—0.21紫草酸0.44—0.44迷迭香酸0.27—0.27丹酚酸B4.05—4.05丹酚酸A0.16—0.16丹参酮ⅡA0.19—0.19隐丹参酮0.20—0.20三七皂苷R1—0.460.46人参皂苷Rg1

—1.751.75人参皂苷Rb1

—2.022.0234药代动力学试验设计三周期自身对照试验设计

健康比格犬8只，雌雄各半，给药剂量均为1ml/kg周期1丹参混悬液：相当于丹参素0.21mg·kg-1，丹参酮ⅡA0.19mg·kg-1，隐丹参酮0.20mg·kg-1

周期2三七混悬液：相当于三七皂苷R10.46mg·kg-1，人参皂苷Rg11.75mg·kg-1和人参皂苷Rb12.02mg·kg-1周期3丹参-三七配伍混悬液

灌服前及灌服后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12、24、48、72、96和120h分别经前肢静脉取血约3.5mL，置肝素化离心管中，900g离心10min分取血浆，于-80℃避光保存供血药浓度测定用。比格犬经过足够长的清洗期后开始下一周期试验。

35血药浓度测定结果配伍前后药动学行为有显著差异：丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1配伍后，AUC减少44%，Cmax显著降低，t1/2缩短，清除速率加快。配伍后，AUC显著降低，Cmax显著减小，CLz/F增大配伍后，AUC显著降低，Cmax显著减小，Tmax延后，CLz/F未见明显变化36血药浓度测定结果配伍前后药动学行为无显著差异：丹参酮ⅡA

、隐丹参酮37小结与讨论药动与药效：配伍对于丹参素和三个皂苷成分的药代动力学行为有较大影响。但这并不一定意味着中药配伍后整体药效的下降。丹参、三七配伍作为经典的药对，其活血化瘀的疗效优于单味药已久经考验。文献报道，人参皂苷Rb1对于心肌细胞长时程增强的活性在5nmol时出现最大值；人参皂苷Rg1和Rb1均在浓度为40µg·mL-1时有最强的神经保护作用，而在更高剂量时无作用甚至出现反作用肠道菌群作用：