标记抗体技术课件(同名1202)

标记抗体技术免疫酶标记技术酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）免疫酶组织化学染色技术斑点-酶联免疫吸附试验一原理酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免疫检测技术。免疫酶相关的免疫制备技术抗体的制备标记用酶抗体标记ELISA：间接法，直接法，夹心法，竞争法免疫组化Dot-ELISA

免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。PreparationofPolyclonalAntibodiesPolyclonalantiserumisgeneratedinanimals(sheep,rabbitsorgoats)withtheintroductionofantigensintotheanimalsbloodstream.Theantiserum(serumfrombloodcontainingthedesiredantibodies)containsamixtureofantibodies,eachofwhichmaybindtodifferentantigenbindingsites(epitopes).Antiserumcontainsamixtureofantibodies.Thismixtureofantibodiesarecalledployclonalantibodies.Anantigenthathasmultiplesitesforantibodybindingiscalledamutivalentantigen.PreparationofMonoclonalAntibodiesMonoclonalantibodiesarehighlyspecificforasingleepitopeonamultivalentantigen.Theyareproducedfromasinglecelllineusinghybridomatechnologyandmousemyelomacelllines.抗体纯化沉淀法硫酸铵盐析辛酸法层析法凝胶过滤层析离子交换层析免疫亲和层析硫酸铵盐析取10ml血清加10ml生理盐水，加入20ml饱和硫酸铵，终浓度为50%。4℃，3h以上，使其充分沉淀。离心弃上清，以10ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵20ml。置4℃3h以上.重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以PBS溶解至10ml装入透析袋。对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止例：兔抗鸭IgG的提纯(辛酸—硫酸铵沉淀法)沉淀溶解透析离心，取上清加辛酸分离鸭血清上清透析过夜加饱和硫酸铵4℃静置10h离心，取沉淀取出分装SDS－PAGE检测实验结果提纯的兔抗鸭IgG的SDS

M：蛋白Marker1：提纯的兔抗鸭IgG2:兔血清凝胶过滤层析

主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。

离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。免疫的亲和层析将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。免疫酶相关的免疫制备技术

用于标记的酶辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP

）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）葡萄糖氧化酶（glucose-oxidase，GO）三、抗体的酶标记过碘酸钠氧化法戊二醛法过碘酸钠法HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基。此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结合，形成HRP—CH2—NH—IgG。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4)还原后，即生成稳定的酶标记物。过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环戊二醛交联标记法戊二醛它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。分为一步法和二步法：HRP一步法将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时混合。HRP、AP与抗体(抗原)的交联。但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活；酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。二步法先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合除去未与酶结合的多余戊二醛后再加入抗体(抗原)，形成酶—戊二醛—抗体(抗原)结合物。其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。

戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶ELISA免疫酶技术(enzymeimmunoassay)：

是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。

就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。酶联免疫吸附试验ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）

是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶（AP）。常见的酶联免疫吸附试验直接法间接法双夹心法竞争法间接ELISA检测抗体检测对象ELISA的一般步骤（以间接ELISA为例）二抗包被抗原一抗：待测血清底物液洗涤封闭洗涤洗涤终止结果判定操作步骤及步骤包被：抗原非特异地吸附在ELISA板上

次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。抗原用包被缓冲液稀释100ul/孔湿盒中，4℃过夜酶标板包被用缓冲液pH9.6碳酸盐缓冲液ELISA板（条）包被用抗原的种类包被抗原的选择是间接ELISA方法建立的关键。常用的包被抗原：克隆表达及纯化的蛋白全微生物：病毒和细菌纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白经过载体偶联的小分子半抗原克隆表达及纯化的蛋白选择合适靶点蛋白的可以鉴别强毒与弱毒的感染，以及感染与免疫引起的抗体。缺点：筛选合适的靶点基因困难。全微生物抗原：病毒和细菌包被前，均需要灭活处理。病毒个体较小，可以直接包被。细菌个体较大，包被前需要对ELISA板进行致敏，如利用戊二醛。缺点是抗原成分比较复杂，交叉反应多。纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白缺点：荚膜多糖的提纯步骤多，难以质控。天然蛋白纯化难以达到理想纯化，而且产量有限。经过载体偶联的小分子半抗原Hapten:Haptenisasmallmoleculewhichisnotantigenicinitselfbutwhenattachedtoalargemoleculecanstimulatetheformationofantibodies.Carrier:Carrierisanimmunogenicsubstancethat,whencoupledtoahapten,rendersthehaptenimmunogenic.

缺点：制备困难

封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。一般封闭的时间为37度2小时封闭可以用BSA、小牛血清、明胶、脱脂乳等。洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：加入一抗一抗即需要检测的血清一抗的稀释倍数根据需要有不同：一般1：100-40037度作用：一般为1-2小时，然后洗涤加入酶标二抗什么是二抗？SPA为什么可以作为哺乳动物广谱性的二抗使用？二抗的稀释倍数根据需要有不同：一般1：1000-10000作用一般为1-2小时洗涤显色HRP的两种底物：OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定。最适吸收波长为450nm。AP的底物：磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。酶反应终止液

常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。AP的终止液用NaOH读数和结果判断

定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。定量是在用酶标仪测出OD值后用公式计算，如P/N值大于2.1也可以用试剂盒中要求的方法进行判定酶标仪ELISA检测抗原

Ag+ Ab*↔Ag-Ab*夹心ELISA检测抗原检测对象ELISA检测抗体检测对象夹心法的适应范围？建立一种夹心法检测病毒颗粒的ELISA方法。竞争ELISA检测

抗原竞争竞争法的适应范围？建立一种竞争法检测小分子抗原的的ELISA方法。免疫组化免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。Directmethod免疫组化(三步法)操作步骤石蜡切片脱蜡至水。3%过氧化氢室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟2次5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。PBS冲洗，5分钟x3次。滴加适量标记二抗工作液，37℃孵育10-30分钟。PBS冲洗，5分钟x3次。滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分钟。PBS冲洗，5分钟x3次。显色剂显色3-15分钟（DAB或NBT/BCIP）自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。IndirectmethodFluorescenceMethodTexasRed,Rodamin,Cy3AMCAFITC,Cy2免疫组织化学的临床