病毒TCID50测定教学提纲

病毒TCID50测定病毒TCID50测定操作步骤准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000~10000个细胞(一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀)。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒(下午传好板第二天早上就能用)。细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。稀释待测病毒液。A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1,10-2-10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500川，即10-1为50ul加入450川的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml,即10-1为100川加入900川孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的,可以根据接种的量自行调整。【！此步操作注意事项：建议每个稀释度接种8个孔,若要统计分析则还要增加至16个孔。病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】（3）接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100川，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】37°CCO2培养箱中孵育1h,取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200ul继续在37CCO2培养箱中培养。（4）培养将培养板放置于CO2培养箱。培养温度，培养天。（5）测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。计算方法1）Spearman-Karber法LgCCID50/0.2m匸—（X0—d/2+dx》R1/N1）X0=全部病变最低稀释度对数d=稀释因数对数N1=每个稀释度所种的孔数R1=病变孔数工=积和LgCCID50/ml=LgCCID50/0.2ml+0.72）Reed-Muench法观察CPE,找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50衰头？滴定病奇TCIDjo计算奁病遶稀释度楼种细胞管鈿胞管数细胞管数黑积总数細胞病妾管比例出现輻胞病变率变管有病娈管10140\4016lezie100%心斗0401212/12100%1034040$e/91QM413144/580%24311411/510%正常对鹽4斗斗40080D/S0%由表看出.病变的病喜稀轻变在ms之间，其中闻距离比？!1按Reed和MuenctL公式计算：丄'zuzz'mzmy"践离比例==高于琢的氐于£需的舷率30—20践离比例==高于琢的氐于£需的舷率30—2080-5030—=0,560ATCID：o=高于50%病变的病言最恵稀释度的对数斗匪离比例屮故能使50%舉睫管发:主病妾的病毒稀释匿为那TCID50为10二・倍・兰疲毒悬须做】0器倍秫釋时・0.1ml申含1个TCID50•作貝-他一些实验时〔如中和试验人一般常100TCID50;0Jml.萨3）判定标准：纸胞对照无病变.在无标准品时.应堵站实验扶敖以减少谋TCID50是指组织培养物（细胞）半数致死计量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。首先我们来看一下这个表示法的意思病毒浓度为10八8.2TCID50/ml它表示的是每ml病毒溶液里含有10八8.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10八XX。这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有多少个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒溶度是xxTCID50/ml.理解了TCID50的概念之后，我们再来看看TCID50是如何计算的？请看例子：H.H.Morales^22^6TCID§0QMculiitioiiDihMktn1<l,ltrni%tkalhj234567B9代仆1210-1a100%B©O®0000®©00©100%10^CQO©Q④④④©QO③④100%1Q^D100%10shOf)0QQQQQQCP1°°%10-6FQO®@®④④®©@OO«»%1O-ToQO00OO0O0G0©0%IO4*H0QQQO00O000Oo%1.(iilcuLauPfopctriiimiiirDhfunee(PD)beieenlikelv»i)diluiionsinbetween5&%death;(%nextabnve51^>nrxtabove5(F%)-(%n»tIn'kiw5ft%)Exampleabove?D紳％■如％竹0%・0%~33$4375Z.<511%tndimbit.Log\tnwr(In=dilutioninliidinisueitabove5(%Exampleabove:Lag沾礪呛件IUJ，or-6AdilPOmrtdLftgIkiwerdiliiticiiiExampleabove;-6+.3^5-6.S75Lfl^TCIDSO-10-6J75or{J2.37M6CilciilatL1CID5Uird.OhiJebytilenil讨讥mtLiLnoculmu^diJ^dtnmu%txasii卩k;ahcA'e：ordingtoourprOkKul.IKIKrrilKIDStTnir2J7xlU^」0(朋25x1(/CalmlHtcPFUM.DividebyconstaatEx.su]iplc*bohu2.37xK)!'x•2.0<10'PFL!ml每个所加液体的体积是0.08ml。图中给出的计算方法是有问题的，请先忽略不看。从图中我们可以知道半数致死的稀释度肯定是介于10八-6到10八-7之间，肯定可以表示成10八-6.xx。那么这个.xx到到底是多少呢？这实际上是一个线性插值的问题。求解见下图：-7.2-7"6.0-6.6-6.4-6.Z-6-S.&PD/[log(dilutionabove50%)-log(dilutionbelow50%)]=[(%nextabove50%)-50%]/[(%nextabove50%)-(%nextbelow50%)]★注意：如果你的病毒是以3倍3倍地稀释那么上面这个公式的log就应该是以3为底的log,其他稀释度与此相类似。在本例子中PD/[(-6)-(-7)]=(80%-50%)/(80%-0%)PD=0.375log(50%的致死的稀释度)=-6-0.375=-6.375求解得到50%的致死的稀释度为10八-6.375根据TCID50的定义，就把这个稀释度所含的病毒的量定义为1个TCID50.在本例中即定义把病毒稀释到10八-6.375梯度后取0.080ml所含的病毒的量为1个TCID50.接下来我们就可以根据这个定义来求原液的病毒溶度。通常求解每ml含有多少个TCID50的病毒。我们先要来求解这个问题：已知把病毒稀释到10八-6.375梯度后取0.080ml所含的病毒的量为1个TCID50,那么病毒原液直接取0.080ml有多少个TCID50.很显然0.080ml病毒原液有10八6.375个TCID50。再求解1ml有多少个TCID50就简单了：设1ml这样的病毒原液就有x个TCID50x/1ml=10八6.375/0.080mlx=10八6.375/0.08=2.9*10八8所以每ml这样的病毒原液有2.9*10八8个TCID50,即该病毒原液的溶度为2.9*10八8TCID50/ml［如果对于上面我说的“很显然“你一时显然不起来的话，我可以帮你举这样的一个例子：你把溶度未知的DNA溶液稀释100倍(即稀释到10八-2稀释度)后取0.080ml去测0D值结果发现这0.08ml的稀释液含有1个ug的DNA，那么很显然可以知道如果直接取0.080ml的原液就应该含有100ug的DNA,该DNA溶液的溶度为100ug/0.080ml=1250ug/ml。如果你还很显然不起来的话，建议你不要从事和理工科相关的工作，你可去当总统什么的，千万别当财政部部长！］说明：我们已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7。将TCID50/ml转换为PFU/ml：T=1x108.3TCID50/ml=1x108.3-0.7PFU/ml=1xlO7.6