实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项

实验室分子生物学实验基本操作标准及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50ng/pl)用灭菌水稀释4倍〔12.5ng/pl〕后分装成10卩1或20pl；连接酶〔solutionI〕按5pl分装；dNTP〔10mM〕分装成50pl；无菌水分装成1ml；注意：〔1〕所有分装都必须用已灭菌的管。〔2〕所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。〔3〕工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。〔4〕当你发现你使用的是最后一管〔盒〕公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。〔5〕感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。每人负责六个月。其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：准备足够量的1.5ml的EP管、两个100ml的离心管、0.22pm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。称取2g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100ml的离心管中。注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。5.把100ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5ml的EP管中，每管0.5ml。在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。6.把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20°C保存。注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制以免耽误使用。表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素〔ampicillin〕100mg/ml50yg/m1〜100yg/ml卡那霉素〔kanamycin〕10mg/ml10yg/m1〜50yg/ml氯霉素〔chloramphenicol〕25mg/mlyg/ml〜25yg/ml链霉素〔streptomycin〕50mg/ml10yg/ml〜50yg/ml四环素〔tetracyyline〕10mg/ml10yg/ml〜50yg/mlIPTG1M-0.6mM三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。四、总DNA的提取具体步骤参考试剂盒说明书。注意:革兰氏阳性菌DNA提取时需要加溶菌酶。五、基因扩增1.引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成〔jinan@sangon 〕。2．引物配制：合成后的引物先离心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50yM,分装至无菌EP管中，做好标记〔一定要标记浓度！后，于-20度保存备用。PCR反应体系配制：将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR反应体系配制。反应体系及反应参数按不同聚合酶的说明书进行，以transgen的easyTaq酶扩增1kb基因序列为例，100口l反应体系为：10Xbuffer10pl,dNTP(10mM)2pl,引物各2pl〔10-50|iM。，模板1pl〔根据浓度加减体积。，Taq酶1pl，ddH2O82pl〔注意：加入顺序为：水，buffer，dNTP，引物，模板，酶〕。涡旋混匀，分装至四-五管，瞬时离心。注意：假设反应时间较长在反应混合液的上层加10-20pl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发。将管放入PCR仪中，在PCR仪上设置好PCR反应参数，例如：94°C5min，94C40sec，Tm55C1min，72C2min，72C10min，16C1h,一般设30个循环。待温度降至16C后停止PCR仪，尽快取出样品，不允许过夜。六、琼脂糖核酸电泳电泳缓冲液的配制：电泳缓冲液一般为TAE〔或TBE〕，其配制方法参见表2,先配制50X母液放于4度冰箱中，电泳时稀释100倍使用。将制胶模具和梳子冲洗干净，架好梳子；根据欲别离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶〔表3〕：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；4．放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化（一般沸三次即好），冷却片刻，倒入制胶模具中，待其凝固；a） 室温下30-45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；b） 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；c） 在DNA样品中加入1/5-1/10体积的上样缓冲液〔1%SDS,50%甘油,0.05%溴酚蓝〕，混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。根据胶的长度设定电压，一般5-8V/cm，电泳20-40min,溴酚蓝跑完胶板的3/4左右即可；电泳完毕，关上电源，戴上手套，将胶放入卩g/ml的溴化乙锭（EB）溶液中，室温下染色5-10min。蒸馏水中漂洗一下，置于紫外灯下或凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。如果要切胶回收，最好在观察台上铺上塑料片观察，防止污染以及紫外灯引起DNA突变。注意：溴化乙锭〔EB〕有剧毒，操作时应注意安全，戴手套操作。但是要防止污染染色池和切胶板以外的区域。操作完后手套和胶分别放入垃圾桶和回收桶。表2.电泳缓冲液TAE配方缓冲液使用液浓贮存液〔每升〕Tris-乙酸〔TAE〕x:2mol/LTris-乙酸50x：242gTris碱05mol/LEDTAml冰乙酸100mol/LEDTA(pH8.0)表3.琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最正确分辨范围琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最正确分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最正确分辨范围〔bp〕0.5%1,000〜30,0000.7%800〜12,0001.0%500〜10,0001.2%400〜7,0001.5%200〜3,0002.0%50〜2,000七、回收与连接将切下的目的条带按照回收试剂盒说明书进行产物回收；连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。稀释好的T载体浓度为12.5ng/yl，不用再确定浓度，每次用量为1灿。连接反应体系的配制〔1〕用SolutionI连接时，取一只分装的SolutionI离心管〔含5ylSolutionI〕，加入待连接的两个DNA样品：载体与片段〔载体与片段的mol比为1：3-5〕，加水补足10yl。〔2〕用T4连接酶5yl连接时，取一只灭菌PCR管，加入10X连接buffer1灿,待连接的两个DNA样品：载体与片段〔载体与片段的mol比为1：-5〕，T4连接酶1yl,加水补足10血〔3〕连接至T载体时反应体系一般为：回收的PCR产物4yl,solutionI5yl,4倍稀释的pMD-18T克隆载体（12.5ng/yl〕1yl。注意：加入顺序为：水，buffer，DNA样品，酶混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。将离心管置于16°C孵育4h以上或过夜。八、E.coliDH5a和B121感受态细胞的制备采用CaCl2制备法制备E.coliDH5a感受态细胞，步骤如下：准备实验：〔1〕准备LB固体培养基和分装于试管〔2-5ml〕和三角瓶〔100ml〕的液体培养基。〔2〕分别配制含15%甘油的和不含甘油的0.1MCaCl2。⑶准备干净培养皿、非常干净的100ml离心管2只，1.5mlEP管50只,1ml和200灿枪尖各一盒。〔4〕将以上培养基和物品高压灭菌。在LB平板上活化iDH5a。将活化的iDH5a单菌落接种于成含LB培养基的试管中，37°C摇床过夜培养。第二天按1%接种量接种到含100mlLB培养基的三角瓶中，37C摇床培养至OD600=0.4-0.6〔约2h〕。600冰浴10min,倒入灭过菌的100ml离心管中离心，4000rpm，10min,4C。去掉上清，加20ml配制好的已灭菌的0.1MCaCl2，将菌体打散后静置20min，4000rpm离心10min，去掉上清。加1-2ml灭菌的0.1MCaCl2(含15%甘油)制成感受态细胞。将制好的感受态细胞分装成50山小份保存于-80C冰箱。E.coliBl21和BL21(DE3)的制备方法同上。注意：〔1〕所有操作均在冰上进行；〔2〕整个制备过程必须保证无菌操作；〔3〕E.coliBl21，BL21(DE3),DH5a菌种每学期更换一次。九、转化取50pl感受态细胞于冰浴上融化。加入10pl连接产物或3-5pl纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴20min。放入42°C水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2-10min。加入ml不含抗生素的LB液体培养基，于37C培养1h。将培养物4000rpm离心3min,保留约200pl上青于管中，将菌体用无菌枪尖轻轻打散，均匀涂布于含100pg/mlAmp+的平板外表，平板于37C先正置1-2h，后倒置培养12-16h至菌落出现。十、重组子的筛选和鉴定从转化平板上挑取白色菌落，转接至含抗生素Amp+〔100pg/ml〕的LB液体培养基，37C振荡培养过夜。菌液可以用以下三种方法验证是否是阳性转化子。注意：同时培养阴性菌落作为对照！〔一〕酚抽验证取1ml菌液12,000rpm离心1min收集菌体，尽量倒干净上清后加入50plTris饱和酚和50pl水，漩涡震荡5min充分混匀。12,000rpm离心10min后迅速取上清进行琼脂糖凝胶电泳。〔二〕质粒酶切验证按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用未插入片段的质粒作为阴性对照，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后可根据质粒的大小初步判断质粒中是否有插入片段，并推测质粒的浓度。利用引物中设计的酶切位点或质粒上的酶切位点，对质粒进行酶切。根据待切质粒的浓度确定要加的体积，选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。在离心管中加入如下成分：10xBuffer2pl待切样品xpl〔一般为5pl左右〕酶 1pl10U/ul加灭菌水补足20pl酶的多少并不是一成不变的，关键要看待切DNA的浓度，如果浓度较低，可以适当少加酶。不要在20pl体系中加入超过2N的酶，那样容易产生星号活性。4、 混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。5、 将离心管置于37°C中温育2h,假设待切样品为PCR产物，则可将反应时间适当延长。最长酶切时间要取决于是否会产生星号活性。如果50灿体系加入1灿酶,则可过夜酶切一般不会出现星号活性。6、 用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注意：当酶切样