双荧光素酶检测原理和方法总结

miRNA靶基因验证实验原理：哺乳动物中不含内源性荧光素酶，转录完成后生成有功能性的荧光素酶，其光产物具有交到的量子效率，检测灵敏度高，已被广泛应用于miRNA靶基因检测。一般截取mRNA3’UTR（野生型、突变型）区域100bp长度构建到荧光素酶质粒上牙UTRtargetSV40IRESLuciferaseINTERACTIONNOINTERACTIONmicraRNARISCcomplexmrercRNARISCcomplexIIRES-LucTranslati-onLOWLEVELLUCTRANSLATIONLuciferase■IRES-Luc *牙UTRtargetSV40IRESLuciferaseINTERACTIONNOINTERACTIONmicraRNARISCcomplexmrercRNARISCcomplexIIRES-LucTranslati-onLOWLEVELLUCTRANSLATIONLuciferase■IRES-Luc *TranslalignLUCrFWNSLATlONWUUUk*Luciferase实验方法：质粒构建预测mRNA与miRNA的结合位点后，截取结合位点前后100bp长度构建到pmirGLO载体上，同时构建结合区域突变载体，如：pmirGLO-mRNA-3’UTR、pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR合成miRNAmimics及NC对照；细胞转染，细胞分组：（1）pmirGLO-mRNA-3’UTR+miRNAmimics（2） pmirGLO-mRNA-3’UTR+miRNAmimicsNC（3） pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR+miRNAmimics（4） pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR+miRNAmimicsNC化学发光检测细胞Luciferas表达活性；5.数据分析。操作流程：1、 细胞培养和转染1） 将指数期细胞传到孔板中，转染时细胞密度约为70%；2） 根据转染的孔的大小，按照一定比例混匀质粒；3） 取一个新的1.5ml离心管，加入lipofectamine2000和Opti-MEM，轻轻混匀后室温静置5min；4） 将4中的混合液加入3的EP管中，混匀；5） 室温静置20min，将lipofectamine2000-质粒混合液滴到U孔板中；6） 4h后换回含血清的完全培养基。2、 Luciferase活性检测1） 取出细胞，室温下吸去培养基，1xPBS洗一遍，每孔加入100ul1xpassivelysisbuffer。2） 把孔板放在摇床上摇15min，转移到EP管中用于后续实验或储存。3） 准备好底物、将LARII从-80°C中取出解冻；StopandGlo:把50xStopandGlosubstrate用StopandGlobuffer酉己成1x；避光放置。4） 把细胞裂解液转移到标记好EP管中、瞬时离心；5） 标记好测量管、每管加入适量细胞裂解液；6） 按说明书设置程序；7） 每测量管加入100ulLARII溶液、快速混匀、测量；8）每测量管加入100ulStopandGlo溶液、快速混匀、测量;9）整理数据。试剂：Lipofectamine®2000