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文档简介

实验六菌落的PCR鉴定

主讲人：邢丹丹一、实验目的：通过本实验学习菌落PCR反应的基本原理与实验技术。二、实验原理：重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。以重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。为什么蓝白斑筛选会出现假阳性：

有可能是载体自连的假阳性。有时即使插入片段也会出现篮斑。只要编码框没被破坏。发生这种情况主要是目的片段插入后不能破坏编码β半乳糖苷酶的读码框，使其依然能和宿主细胞的C端形成α互补。有可能连接体系有外源性核酸酶污染，使T-载体变为平端，连接后由于移码，而生成白斑。蓝白斑筛选结果三、仪器、材料与试剂PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5μL）、200μLPCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000μL量程各一支）、100mL或250mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。四、PCR反应体系1、模板：菌液2、引物：

P15′-CGGGTACCGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGG-3′P25′-ACTCTAGATGAGTAAAACAGAGGAGGGTCTCAC-3′3、DNA聚合酶：Taq（本制品是94KD的耐热性DNA聚合酶。它与天然的DNA聚合酶具有相同的功能。使用本制品扩增得到的PCR产物的3‘端附有一个A碱基，因此可直接克隆与T-Vector中。）4、原料：dNTPMixturedATP、dGTP、dCTP、dTTP等摩尔的混合物。5、反应缓冲液10×PCRBuffer的组成。五、实验步骤

在200μLPCR管内配制20μL反应体系：反应物体积/μL

模板DNA2.0

灭菌蒸馏水（ddH2O)10.310×PCR缓冲液2.0dNTP（2.5mM）1.6

引物1（2μM）2.0

引物2（2μM）2.0rTaq酶（1.0单位）0.1

Total20

将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000rpm离心15sec使反应成分集于管底。Mix（18

μL

）

用200μL的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15μL无菌水中，吹打混匀，切记勿离心，从中取2μL菌液作为菌落PCR模板。

六、PCR反应热循环程序设置①94℃预变性5min;②94℃变性30sec;③64℃退火30sec;30cycles④72℃延伸1min;⑤72℃延伸5min;⑥4℃pause

配制1％的琼脂糖凝胶。取5μLPCR产物加1μL6×loadingbuffer于1%的琼脂糖凝进行电泳剩余的13μL菌液置4℃保存备用。七、摇菌从冰箱中取出氨苄青酶素，先放置冰上，弹匀后离心。取15mL的离心管，每个管中加2mL的LB液体培

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