发根农杆菌诱导桑树毛状根体系的建立

发根农杆菌诱导桑树毛状根体系的建立孔卫青;杨金宏;卢从德【摘要】应用发根农杆菌ACCC10060,以直接接种和共培养2种方法侵染桑树10d龄子叶，并将2种处理的外植体分别接种于MS+AS（乙酰丁香酮,100pmol/L）的平板,暗培养2d后转接至MS+CS（头孢霉素,200mg/L）平板培养3周，每3d转接1次以除去其中所含的发根农杆菌菌体，结果2种侵染方法均成功诱导桑树产生毛状根，诱导效率分别为14%和17%.在无激素MS培养基上离体培养除菌后的毛状根，呈现旺盛的生长态势和典型的发状根结构特点.CTAB法提取毛状根基因组并进行PCR检测，结果扩增出了423bp的rolB基因片段，表明Ri质粒的T-DNA已经成功整合到桑树的基因组中.【期刊名称】《西北植物学报》【年（卷），期】2010（030）011【总页数】4页（P2317-2320）【关键词】桑树;发根农杆菌;毛状根;诱导【作者】孑L卫青;杨金宏;卢从德【作者单位】安康学院，陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康,725000;安康学院，陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康,725000;安康学院，陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康,725000【正文语种】中文【中图分类】Q789Abstract:Usingdirectinfectionandco2culturingwithbacteriamethod,102daysmulberrycotyledonwerewound2inoculatedwithAgrobacteriumrhizogenesstrainsACCC10060inordertoobtainhairyroots.Ex2plantswereculturedindark2daysontheMS+AS(Acetosyringone,100pmol/L),thentransferredontoMS+CS(Cefotaximsodium,200mg/L)inordertocurethebacteria,andreplacedevery3daysfor3weeks.Bothinfectionmethodsweresuccessfullyobtainedmulberryhairyroots,andtherateofinductionare14%and17%,respectively.TherootgrewvigorouslyonMSmediumwithoutanyhormoneandhashairyrootcharacters.GenomicDNAofthehairyrootswasextractedbyCTABmethodanda423bpfrag2mentwasamplifiedwithprimersofrolB,indicatedthatT2DNAofRihadintegratedintomulberrygenome.Keywords:mulberry;Agrobacteriumrhizogenes;hairyroots;induction根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)均是革兰氏阴性土壤细菌，分别应用其Ti质粒和Ri质粒侵染植物伤口进入细胞,并将其上含有的一段T2DNA插入到植物基因组中［1］。但因为野生型根癌农杆菌Ti质粒的T2DNA上具有致病基因，该基因的表达和植株再生不相容，所以通常将目的基因插入到经过维呷”改造的T2DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株［2］。而野生型发根农杆菌Ri质粒的TL2DNA上有rolA2D基因群,TR2DNA有tms基因,能诱发被感染植物的受伤部位产生大量的毛状根［3］,且Ri质粒T2DNA上的基因不影响植株的再生，转化效率高启前已在甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、烟草(Nicotianataba2cumL.)、蓝猪耳(ToreniafournieriL.)、钝莨菪(Hy2oscyamusmuticusL.)等中获得成功［427］。同时，发根农杆菌也可以转化双元Ti质粒，将Ti质粒上的一段DNA整合进植物基因组,稳定地遗传给后代，且发根农杆菌能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物，所以利用发根农杆菌诱导植物细胞产生毛状根是20世纪80年代发展起来并得到广泛应用的植物基因工程技术，在植物代谢物的生产上显示了巨大的应用潜力［8,9］。桑树(MorusalbaL.)是蚕桑生产的主要物质基础，同时桑树中也含有大量的次生代谢物,具有重要的经济和研究价值。在桑树的基因工程研究上启MachiiH采用根癌农杆菌(Agrobacteriumtu2mefaciens)叶盘转化系统成功地将外源基因导入桑叶盘，并获得转化株以来，根癌农杆菌在桑树的基因工程上得到了广泛的应用［10］。Sandhya等［11］利用根癌农杆菌和桑细胞共培养的方法也获得了转化植株。陆小平等［12］用根癌农杆菌整株转化方法对真叶开放期的桑苗进行试验，也成功获得了桑树的转基因植株。但目前还没有利用发根农杆菌进行桑树毛状根诱导及转基因研究的报道，本实验利用发根农杆菌ACCC10060侵染桑树10d龄子叶，成功建立了一种简单、易于操作的发根农杆菌介导的桑树毛状根的诱导体系，为桑树的转基因和桑树毛状根次生代谢物的研究利用奠定了基础。1.1植物夕卜植体的准备选取当年收获的桑树’沙2’品种的种子，蒸馏水冲洗1h,75%乙醇浸泡15min,30%H2O2浸泡5min,无菌水冲洗4~6次后，无菌滤纸吸干表面水分。用酒精灯灼烧消毒后的镊子将消毒后的种子接种于MS固体平板上,置于25°C,12h光照条件下培养，约1周后种子萌发，长出子叶。暗培养2~3d,待用。1.2供试菌株的活化供试菌株为野生型发根农杆菌ACCC10060,购自中国农业微生物保藏中心。划线发根农杆菌ACCC10060于YEB平板,25C避光培养2d长出菌落，连续划线活化培养2次后，应用2种方法对供试菌株进行再次活化。方法一:继续划线平板培养一次。方法二挑单菌落于YEB液体培养基中,25^,180r/min振荡培养至OD600为0.6~0.8,离心收集菌体，用MS培养基重悬至OD600为1.0。1.3桑树毛状根的诱导用直接接种法和共培养法诱导桑树产生毛状根。（1） 直接接种法用刀片切下1.1中萌发种子长出的子叶,接种针轻微创伤子叶正面,再于1.2方法一活化的发根农杆菌ACCC10060菌斑上轻轻蘸下。（2） 共培养法将创伤后的桑树子叶置于1.2方法二活化并重悬于MS培养基的发根农杆菌AC2CC10060菌液中10min。将2种处理的外植体分别接种于MS+AS（乙酰丁香酮,100Mmol/L）的平板，暗培养2d后，转接至MS+CS（头孢霉素,200mg/L）平板上继续培养，每3d转接1次以除去其中所含的发根农杆菌ACCC10060的菌体。1.4毛状根的离体培养与PCR检测剪取经3周除菌培养后的毛状根根尖2~3cm,置于MS培养基进行离体培养。根据发根农杆菌ACCC10060的Ri质粒的TL2DNA上的rolB基因的序列设计引物,然后PCR扩增rolB基因,以检测其是否成功转入桑树，引物序列为rolBF:5'2GCTCTTGCAGTGCTAGATTT23，;rolBRS2GA2AGGTGCAAGCTACCTCTC23',引物由上海生工生物工程有限公司合成。取除菌完全的毛状根基部适量,CTAB法提取基因组DNA,同时用正常桑树叶片的基因组DNA做对照,进行PCR扩增。扩增反应采用25"体系,程序为94°C预变性4min;95°C30s;57C30s;72C40s,30个循环;最后72C再延伸6min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳,EB染色，紫外灯下检测。2.1不同方法诱导桑树产生毛状根的效率应用直接接种法和共培养法进行发根农杆菌ACCC10060侵染桑树子叶，外植体经MS+AS（乙酰丁香酮,100pmol/L）平板、MS+CS（头孢霉素,200mg/L）平板培养,2种侵染方法均成功诱导桑树产生毛状根,其中共培养法的诱导桑树产生毛状根的效率为17%,直接接种法为14%（表1）,共培养方法的诱导效率高于直接接种法。但由于直接接种法操作方便，而且该方法诱导产生的桑树毛状根的生长速度快于共培养法因此，本研究后续实验采用直接接种法诱导获得的桑树毛状根进行。2.2桑树毛状根的离体培养创伤的桑树子叶经直接接种法处理1周后，伤口部位长出白色突起,2周后分化为白色细根，且根的密度较大，生长速度快，生长的根向地性（图1,A）。3周后毛状根的颜色开始变黄,子叶逐渐枯萎（图1,B）。此时分别剪取2-3cm根尖置于MS培养基进行离体培养，离体的毛状根能在MS培养基上自主生长，且生长速度快,形成大量分支,2个月后鲜重约为原来的20倍（图1,C）。2.3桑树毛状根的PCR检测取18个毛状根组织提取基因组,进行rolB基因的PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析扩增到一条423bp的条带，与预期大小一致，而同时以正常桑叶片的基因组DNA为模板没能扩增到该条带（图2）,说明Ri质粒的T2DNA已经成功整合到桑树的基因组中,所获得的毛状根为发根农杆菌诱导产生的遗传转化体。共培养方法是诱导毛状根的一种经典方法具有广泛的应用。但该方法操作相对复杂,对实验者的操作技能有一定的要求，同时需要使用一些大型的设备。本研究同时使用了共培养和直接接种法，虽然共培养的诱导效率略高于直接接种法,但差异不大,而相对于共培养方法,直接操作法操作简便，不需要低温离心机等大型的贵重仪器，适合大多数的科研院所使用。发根农杆菌诱导植物产生毛状根的影响因素很多，如菌液浓度、共培养时间、AS浓度等［13,14］。其中菌液浓度是转化过程中常常被调整的因素，菌液浓度过高,发根农杆菌生长过快，不易被抗生素杀死.易导致外植体受到伤害、发生褐化甚至死亡；菌液浓度过低，又无法感染外植体。本实验采用的创伤子叶直接接种发根农杆菌的方法基本忽略了上述因素,操作简单且容易重复。这也可能与实验采用子叶为夕卜植体有关子叶特别肥厚，贮藏着大量的营养物质，诱导的过程中可提高生根率,且不会因为菌液浓度过大而导致死亡。毛状根可在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，还能够合成许多悬浮细胞培养所不能合成的物质，某些产物的产量甚至高于正常植物及悬浮细胞培养[15]。因此，毛状根培养系统在生物量的增加、药用有效成分的积累以及生产稳定性方面，都显示了其独特的优越性。到目前为止，国内夕卜现已成功地培养出黄芪、紫草、红花、青蒿、决明等药用植物的毛状根，人参皂或、黄连素等已通过毛状根培养得以工业化生产[16]。桑树的根中含有大量的次生代谢物质，具有重要的研究价值，而桑树毛状根的研究在国内外尚属空白，本实验描述了一种简便易行的桑树毛状根诱导方法，成功获得了桑树的毛状根，为桑树毛状根次生代谢物的利用和桑树转基因研究奠定了基础。【相关文献】GELVINSB.Findingawaytothenucleus[J].Cur.OpinioninMicrobiol,2010,13:53-58.HOEKEMAA,HIRSCHPR.AbinaryplantvectorstrategybasedonseparationofvirandTregionoftheAgrobacteriumtumefaciensTi2plasmid[J].Nature,1983,303:179-180.SCHMBLLINGT,SCHELLJ,SPENAA.PromotersoftherolA,BandCgenesofAgrobacteriumrhizogenesaredifferentiallyregulatedintransgenicplants[J].PlantCell,1989,1:665-670.LUHY,LIUJM,ZHANGHC,TAOY,GAOSL.Ri2mediatedtransformationofGlycyrrhizauralensiswithasqualenesynthasegene（GuSQS1）forproductionofglycyrrhizin[J].PlantMol.Biol.Rep.,2008,26:1-11.CUIH（崔红）,MUPL（慕平利）,LIXJ（李雪君）,LIUML（刘梦林）WANGZH（王^.Expressionoffarnesyldiphosphatesyn2thasegene（fps）inNicotinantabacumhairyrootviaRi2mediatedtransformation[J].JournalofZhejiangUniversity（Agriculture&LifeScience）（浙江大学学报•农业与生命科学版）,2007,33（4）:355-359（inChinese）.TAOJ,LIL.GenetictransformationofToreniafournieriL.mediatedbyAgrobacteriumrhizogenes[J].SAfr.J.Bot.,2006,72:211-216.JOUHIKAINENK,JOKELAINENT,HILTUNENR,TEERITH,OKSMAN2CALDENTEYKM,LINDGRENL.EnhancementofscopolamineproductioninHyoscyamusmuticusL.hairyrootculturesbygeneticengineering[J].Planta,1999,208（4）:545-551.FUCX,ZHAODX,XUEXF,JINZP,MAFS.TransformationofSaussureainvolucratabyAgrobacteriumrhizogenes:Hairyrootin2ductionandsyringinproduction[J].ProcessBiochem.,2005,40:3789-3794.JINUH,CHUNJA,HANMO,LEEJW,YIYB,LEESW,CHUNGCH.Sesamehairyrootculturesforextra2cellularproductionofarecombinantfungalphytase[J].ProcessBiochem.,2005,40:3754-3762.MACHIIH.Leafdisktransformationofmulberryplant（MorusalbaL.）byagrobacteriumTiplasmid[J].SericultureScienceofJa2pan,1990,59:105-110.SANDHYAA,KAMLESHK,SAININ,JAINRK.AgrobacteriumtumefaciensmediatedgenetictransformationandregenerationofMorusalbaL.[J].ScientiaHorticulturae,2004,100:183-191.LUXP（陆小平）,LOUCHF（楼程富）,SHENFY（沈飞英）,MINEOK（小岛拳雄）.MolecularidentificationandphenotypeanalysisoftransgenicmulberryplantbyAgrobacteriumtumefaciensT2DNAintroduction[J].Jour