典型产品的分离纯化工艺-大蒜细胞SOD的提取与分离（药物分离纯化课件）

药物分离与纯化技术课程典型产品的分离纯化工艺--大蒜细胞SOD的提取与分离大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺大纲1.实验目的2.实验原理3.实验方法及步骤大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺（一）实验目的学习超氧化物歧化酶的提取与分离方法（二）实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2－＋H2＝＝O2＋H2O2。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺（1）新鲜蒜瓣（2）磷酸缓冲液：0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲溶液。（3）氯仿－乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇＝3：5（V/V）。（4）丙酮：用前冷却至4－10℃。（5）碳酸钠溶液：0.2mol/L。(6)EDTA溶液：0.1mol/L。(7)肾上腺素液：1mg/mL。（三）材料和试剂大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺1．组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。（四）实验方法及步骤大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺2．SOD的提取将上述破碎的组织或细胞，加入2－3倍体积的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000rpm，离心15min，弃沉淀，得提取液。（四）实验方法及步骤大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺3．除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000rpm离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。（四）实验方法及步骤大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺

4．SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液中，于55－60℃热15min,离心弃沉淀，得到SOD酶液。将上述粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。（四）实验方法及步骤大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺试剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液0.50.50.5蒸馏水0.50.5－样品液－－0.5

混合均匀肾上腺素液－0.50.55．SOD活力测定取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液(ml)（四）实验方法及步骤大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应5min，然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管与样品管的光密度值分别为A和B。（四）实验方法及步骤分光光度计大蒜细胞SOD的提取与分离—典型产品的分离纯化工艺在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：酶活力（单位）＝2·（A－B）·N/A式中：N――样品稀释倍数；2――抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。

若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算：酶活力单位/ml＝2·（A－B）·N/A·V/V1＝26·（A－B）·N/A式中V――反应液体积（6