流式细胞术数据的稳态分析1

本小插图将指导你分析来自实验的流式细胞术数据集示例，该实验检查芽殖酵母液体培养物中合成生物回路的荧光报告基因水平。在这里，我们分析了一个电路，其中荧光报告基因与蛋白质融合，在添加诱导分子后，该蛋白质会随着时间的推移而降解。在诱导后的某个时间（由实验者优化），通过流式细胞术分析这些培养物的荧光。在这里，我们演示如何将生成的.fcs文件导入到R中，使用实验元数据（例如每个样本的strain和treatment）注释该数据，并编译相关事件和测量结果。#导入和注释数据使用导入流式细胞术数据read.flowset。在这里，我们将导入一个示例flowSet。plate1<-read.flowSet(path=system.file("extdata","ss_example",package="flowTime"),s=TRUE)#addplatenumberstothesampleNamessampleNames(plate1)<-paste("1_",sampleNames(plate1),sep="")dat<-plate1如果你有多个板，则可以重复此代码，并且可以组合每个板以组装完整的数据集。plate2<-read.flowSet(path=paste(experiment,"_2/",sep=""),s=TRUE)sampleNames(plate2)<-paste("2_",sampleNames(plate2),sep="")dat<-rbind2(plate1,plate2)对于本示例，我们将导入元数据表。sampleNames组装的（flowSet在dat本示例中）的必须与的唯一标识符列的相匹配annotation。annotation<-read.csv(system.file("extdata","ss_example.csv",package="flowTime"))head(annotation)#>XnameAFBIAAtreatmentrepl#>11_A01.fcs1_A01.fcsTIR1IAA10.001#>21_A02.fcs1_A02.fcsTIR1IAA170.001#>31_A03.fcs1_A03.fcsAFB2IAA10.001#>41_A04.fcs1_A04.fcsAFB2IAA170.001#>51_B01.fcs1_B01.fcsTIR1IAA10.051#>61_B02.fcs1_B02.fcsTIR1IAA170.051sampleNames(dat)#>[1]"1_A01.fcs""1_A02.fcs""1_A03.fcs""1_A04.fcs""1_B01.fcs""1_B02.fcs"#>[7]"1_B03.fcs""1_B04.fcs""1_C01.fcs""1_C02.fcs""1_C03.fcs""1_C04.fcs"#>[13]"1_D01.fcs""1_D02.fcs""1_D03.fcs""1_D04.fcs""1_E01.fcs""1_E02.fcs"#>[19]"1_E03.fcs""1_E04.fcs""1_F01.fcs""1_F02.fcs""1_F03.fcs""1_F04.fcs"#>[25]"1_G01.fcs""1_G02.fcs""1_G03.fcs""1_G04.fcs""1_H01.fcs""1_H02.fcs"#>[31]"1_H03.fcs""1_H04.fcs"sampleNames(dat)==annotation$name#>[1]TRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUE#>[16]TRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUETRUE#>[31]TRUETRUE我们还可以从我们的数据集创建此列并附加注释列。或者，可以使用该createAnnotation函数创建一个具有适当列的数据框，name然后可以通过R代码填充该数据框，或另存为csv文件并通过电子表格编辑器填充。中的条目顺序annotation并不重要，只要能够sampleNames(dat)表示中的每个条目即可。该annotateFlowSet函数将按mergeBy列匹配条目annotation<-cbind(annotation,name=sampleNames(dat))#orannotation<-createAnnotation(yourFlowSet=dat)write.csv(annotation,file="path/to/yourAnnotation.csv")最后，我们可以使用该函数将此元数据附加到flowSet

annotateFlowSet。adat<-annotateFlowSet(yourFlowSet=dat,annotation_df=annotation,mergeBy="name")head(rownames(pData(adat)))#>[1]"1_A01.fcs""1_A02.fcs""1_A03.fcs""1_A04.fcs""1_B01.fcs""1_B02.fcs"head(pData(adat))#>nameXAFBIAAtreatmentrepl#>1_A01.fcs1_A01.fcs1_A01.fcsTIR1IAA10.001#>1_A02.fcs1_A02.fcs1_A02.fcsTIR1IAA170.001#>1_A03.fcs1_A03.fcs1_A03.fcsAFB2IAA10.001#>1_A04.fcs1_A04.fcs1_A04.fcsAFB2IAA170.001#>1_B01.fcs1_B01.fcs1_B01.fcsTIR1IAA10.051#>1_B02.fcs1_B02.fcs1_B02.fcsTIR1IAA170.051现在我们可以保存这个flowSet，任何人都可以轻松加载和分析这个带注释的flowSet！write.flowSet(adat,outdir="your/favorite/directory")#ReadtheflowSetwiththesavedexperimentalmetadataread.flowSet("flowSetfolder",path="your/flow/directory",phenoData="annotation.txt",s=TRUE)#编译和绘制数据现在我们准备分析此中的原始数据flowSet。首先，我们加载将用于对数据进行子集化的门集。为了分析这个稳态或单时间点实验，我们将使用该steadyState函数。该函数将对每个事件进行门控，并编译并返回flowFrame每个事件的相关数据和元数据。然后可以使用它来可视化完整的数据集。flowSetdataframedataframeloadGates()#usethedefaultincludedgateSetdat.SS<-steadyState(flowset=adat,ploidy="diploid",only="singlets")#>[1]"Gatingwithdiploidsingletgates..."#>[1]"Convertingevents..."p<-ggplot(dat.SS,aes(x=as.factor(treatment),y=FL2.A,fill=AFB))+geom_boxplot(outlier.shape=NA)+facet_grid(IAA~AFB)+theme_classic(base_family="Arial",base_size=16)+ylim(c(-1000,10000))