阴沟肠杆菌产金属内酰胺酶的基因检测

阴沟肠杆菌产金属内酰胺酶的基因检测

近年来，随着碳青霉烯酸酯的广泛应用，其抗药率逐年提高。在越来越多的耐药性细菌中发现了金属酶，大多数金属酶对大多数内酰胺类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生素类抗生。阴沟肠杆菌对碳表霉烯类抗生素的耐药机制中,产生金属β内酰胺酶(Metallo-beta-lactamase,MBL)是目前研究较少的一类。了解医院感染阴沟肠杆菌产金属酶的情况,将有助于抗生素的合理使用及对耐药阴沟肠杆菌的流行进行有效的控制。11.11.1.1阴沟肠杆菌的分离和鉴定实验所用的菌株来自湘雅三医院2007年1月～2007年6月临床分离的阴沟肠杆菌40株,用法国梅里埃公司的VITEK-2全自动细菌鉴定。1.1.2美罗培南mer和mh培养基头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢西丁(FOX)、头孢吡肟(FEP)、头孢曲松(CRO)、头孢哌酮/舒巴坦(CFS)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、环丙沙星(CIP)、亚胺培南(IMP)、复方新诺明(SXT)、阿米卡星(AMK),替卡西林/克拉维酸(TCC),美罗培南(MER)和MH琼脂均购自英国Oxoid公司。1.1.3标准操作及判断结果采用K-B琼脂扩散法,结果并根据CLSI2005年版标准操作及判断结果。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。对菌株统一进MIC的测定,严格按照临床实验室标准化研究所CLSI推荐的琼脂稀释法测定抗菌药物的MIC值1.1.4需要设计的引物blaVIM引物序列为:VIM-F:5′-AAAGTTATGCCGCACTCACC-3′VIM-R:5′-TGCAACTTCATGTTATGCCG-3′blaIMP引物序列为:IMP-F:5′-GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC-3′IMP-R:5′-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3′引物设计参考文献1.21.2.1用联合法检测金属内酰胺酶在直径9mm的MH琼脂平板上,按K-B法药敏试验方法接种待测菌后,在正中贴上EDTA-Na1.2.2温度和时间用煮沸法提取细菌总DNA。总反应体系为50μL,聚合酶链反应条件为:预变性温度94℃,4min,然后进行30次94℃1min,55℃1min,72℃1min循环,最后72℃10min充分延伸。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外凝胶电泳成像仪下观察结果。22.1fep的耐药性本组菌株对MER无耐药,对IPM的耐药率7.5%,FEP的耐药率为12.5%,对其他抗菌药物的耐药率在52.5%～92.5%。表明对40种抗菌药物耐药性均严重。40株阴沟肠杆菌对抗菌药物的敏感性见表1。2.2亚胺培南、金属酶阳性菌株的筛选院内感染标本分离的40株阴沟肠杆菌中耐亚胺培南的菌株有4株,占10.0%(4/40),纸片筛选出产金属酶阳性3株,占7、5%(3/40)。2.3PCRPCR检测金属blaVIM阴性,而blaIMP阳性2株,(2/40,5.0%)。扩增结果见图1。3阴沟肠杆菌金属酶表型基因型检测近年来,阴沟肠杆菌已成为院内感染越来越重要的病原体,由于第三代和第四代头孢菌素、碳青霉烯类以及氟喹诺酮类等超广谱抗菌药物在临床上广泛使用,使其在选择性压力下不断发展耐药机制,多重耐药日益严重,特别是对碳青酶烯类抗菌药物耐药株的出现令抗菌感染治疗相当困难。实验结果显示阴沟肠杆菌对临床常用的14种抗生素均有不同程度的耐药性,对碳霉烯类抗生素亚胺培南的耐药率为7.5%,同李岩等产金属酶是阴沟肠杆菌对亚胺培南耐药的重要机制,金属酶是β内酰胺酶家族中研究得较少得一类,但其水解底物很广泛,特别是通过整合子介导的金属酶的存在,提示今后几年内,金属酶可能快速传播,产酶株将增多。目前已知,根据编码基因同源的不同产金属酶菌株的基因型主要有IMP、VIM、SPM和GIM这四种,以前两种较多见,对临床最具危险性的是获得性金属酶(IMP型和VIM型),它们不仅可分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中,而且还可以通过整合子或质粒等水平扩散。阴沟肠杆菌产金属β内酰胺酶在不同的地域已经被报导,IMP-8型见于台湾本试验以EDTA作为金属酶的抑制剂,采用双纸片协同试验检测临床分离的阴沟肠杆菌金属酶产生情况,金属酶的检出率为7.5%(3/40),提示在院内临床分离的阴沟肠杆菌中已有金属酶的产生并处于一定的水平,产金属酶的阴沟肠杆菌会对所有的β-内酰胺类抗生素包括三代、四代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素产生耐药,导致临床抗感染治疗的失败。为了进一步对阴沟肠杆菌耐药性的传播机制进行研究,本研究对金属酶表型筛选阳性的3株阴沟肠杆菌进行了金属酶基因存在状况检测,PCR扩增结果表明:该3株菌中有2株携带IMP型金属酶基因,另外-株金属酶表型阳性的菌株基因检测阴性,可能与本研究仅采用2种金属酶基因型引物进行金属酶基因的检测,而这-株金属酶表型阳性的菌株所产的金属酶属于其他基因型别有关,具体有待进一步研究。产生金属酶的阴沟肠杆菌常由于同时伴有其他耐药机制,如产生其他β内酰胺酶、