DNA凝胶电泳常用试剂配制

DNA的凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围凝胶中的琼脂糖含量〔％（w/v）〕线状DNA分子的有效分离范围（kb）0.35—600.61－200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—32.00.1—2常用电泳缓冲液缓冲液使用液浓储存液（每升）Tris-乙酸(TAE)1x：0.04mol/LTris—乙酸0.001mol/LEDTA50x：242gTris碱57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-磷酸(TPE)1x:0.09mol/LTris-磷酸0.002mol/LEDTA10x:108gTris碱15.5ml85%磷酸(1.679g/ml)40ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-硼酸(TBE)a0・5x:0.045mol/LTris硼酸0.001mol/LEDTA5x:54gTris碱27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)碱性缓冲液b1x：50mmol/LNaOH1mmol/LEDTA1x:5ml10mol/LNaOH2ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)a.TBE浓溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5X溶液，出现沉淀后则予以废弃。以往都以1XTBE作为使用液（即1：5稀释浓贮存液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5X的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的1XTBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的2倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流通量通常较大，需要使用1XTBE以提供足够的缓冲容量。b.碱性电泳缓冲液应现用现配。

凝胶加样缓冲液缓冲液类型6X缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF40%(w/v)蔗糖水溶液4°CII0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(Ficoll)(400型；Pharmacia)水溶液室温III0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液4CW0.25%溴酚蓝40%(w/v)蔗糖水溶液4C碱性加样缓冲液V300mmol/LNaOH6mmol/LEDTA18%聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液0.15%溴甲酚绿0.25%二甲苯青FF4C使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品浓度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；含有在电场中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中泳动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5XTBE作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5—1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚蓝更为鲜明。聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺〔％（w/v）〕a有效分离范围（bp）二甲苯青FFb溴酚蓝b3.51000—20004601005.080－500260658.060—4001604512.040—200702015.025—150601520.06—1004512N,N'-亚甲基双丙烯酰胺占丙烯酰胺浓度的1/3.给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片断的粗略大小（核苷酸对）30％丙烯酰胺：丙烯酰胺29gN,N'-亚甲基双丙烯酰胺1g加水至100ml将溶液加热至37°C使化学药品溶解小心：丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收。丙烯酰胺的作用具有累积性。称取粉末状丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺时必须带手套和面具。取用含上述化学药品的溶液也要戴手套。尽管可以认为聚丙烯酰胺无毒，但鉴于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺，故仍应小心处理。10％过硫酸铵过硫酸铵1g加水至10ml可在4C保存数周。制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积（总体积100ml）制备不同浓度（％）凝胶所用试剂的毫升数试剂-3.5%5.0%8.0%12.0%20.0%30％丙烯酰胺11.616.626.640.066.6水67.762.752.739.312.75