真菌的培养技术-真菌的培养方法

微生物通过新陈代谢把营养物质转变成细胞物质，增加个体重量的过程。生长：细胞生长到一定程度进行分裂，产生同亲代相似的子代细胞的过程。

繁殖：生长是一个逐步发生的量变过程;繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。单细胞微生物，生长导致细胞数量增加（细胞个体增长到一定程度就分裂成两个大小基本相等的子代细胞）。多细胞微生物（某些霉菌），生长意味着细胞数目增加而个体数目不变，只能叫生长，而不能叫繁殖（只有通过形成无性或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫繁殖）。I个体细胞生长概述一、细菌细胞的生长1.染色体DNA的复制和分离细胞伸长和DNA复制DNA分配和隔膜开始形成杆菌在生长过程中，新合成的肽聚糖是在多个位点插入到老细胞壁中，新老细胞壁呈间隔分布。球菌在生长过程中，新合成的肽聚糖是在赤道板附近插入，导致新老细胞壁明显分开，原来的老细胞壁推向细胞两端。2、细胞壁的扩增荧光抗体技术3、细菌的分裂隔膜完全形成子细胞分离DNA分配和隔膜开始形成当细菌的各种细胞结构复制完成之后就进入分裂时期，此时在细菌长轴的中间位置，通过细胞质膜内陷并伴随新合成的肽聚糖插入，导致横隔壁向心生长，最后在中心汇合，完成一次分裂，通常情况下，将一个细胞分裂成两个大小相等的子细胞。二、酵母细胞的生长繁殖细胞分裂期M间隔期G1DNA合成期S第二间隔期G2核膜上的纺锤体斑通过复制由一个变为两个，DNA开始复制，芽体出现。纺锤体斑产生约15根微管，其中一个纺锤体斑沿核膜移动180度，从而使两个纺锤体斑通过直线形的微管连在一起。芽体增大，细胞核移到母细胞与芽体交界处，微管延长。细胞核有丝分裂，其中一个核进入芽体，芽体子细胞与母细胞之间的壁开始合成，随后子细胞与母细胞分离，或暂时不分离（如假丝酵母属）继续出芽。三、霉菌菌丝的延伸过程

顶端生长需要高尔基体、内质网等细胞器参与。在菌丝的亚顶端区富含内质网和核糖体等细胞器。细胞膜脂肪和蛋白质在亚顶端区的内质网中合成后，通过小泡囊转移到高尔基体的近侧潴泡中，由高尔基体转向远侧时，成熟而分泌泡囊。分泌的泡囊从亚顶端区移向顶端，泡囊与细胞膜融合形成细胞膜。同时释放出细胞壁分解酶与合成酶，分解酶使壁组份间的键断裂，合成酶催化合成新壁成分，并将其转移到壁区形成新壁。“菌丝尖端生长的泡囊假设”II微生物的群体生长一、单细胞微生物的典型生长曲线将少量纯种非丝状单细胞微生物接种到恒容积的新鲜液体培养基中，在适宜的温度、通气等条件下培养，定时取样测定单位体积里的细胞数，以单位体积里细胞数的对数作纵坐标，以培养时间为横坐标，画出的曲线，就是非丝状的单细胞微生物的典型生长曲线。典型生长曲线根据微生物的生长速率常数R（即每小时的分裂次数）的不同，一般可分为迟缓期（延滞期）、指数期、稳定期和衰亡期等四个时期。1.延滞期（Lagphase），也称迟缓期、延迟期、适应期。将少量菌种接入新鲜培养基后,在开始一段时间内菌数不立即增加,或增加很少，生长速度接近于零。此时细胞特点可概括为：分裂迟缓、代谢活跃。该期的具体特点为：①生长速率常数为零；②细胞形态变大或增长，尤其是长轴最为明显，许多杆菌可长成丝状；③细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；④合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，容易产生各种诱导酶；⑤对外界条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。迟滞期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。调整代谢迟滞期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。缩短迟滞期的常用手段：(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量。2.指数期（Exponentialphase），又称对数期（Logphase)指紧接迟滞期之后，细胞以几何级数增长的一段时期。三个重要参数的计算：繁殖代数(n)、生长速率常数(R)、代时(G)

指数期的特点：①生长速率常数R最大且为常数，细胞每分裂一次所需的时间（称为代时，或世代时间，或增代时间，或倍增时间，用G表示）最短且稳定；②细胞进行平衡生长，菌体各部分的成分十分均匀；③酶系活跃，代谢旺盛。

t1

–t01G=——————=—————

nR注意：只有处于指数期，才符合以上计算公式纳米细菌(nanobacteria)，三天才分裂一次；九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。

影响代时的因素：1）菌种：不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；2）营养成分：在营养丰富的培养基中生长代时短；3）营养物浓度：在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。4）温度：在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。指数期细胞的应用：适宜作“种子”；研究基础代谢的材料；噬菌体增殖的最好阶段；革兰氏染色；诱变育种；3.稳定期（Stationaryphase）指数期之后，培养液中活细菌数最高并维持稳定的阶段(可能由于细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数，或者细胞仅停止分裂而保持代谢活性)。稳定期特点：①生长速率常数R降低至0；②代时G延长；③细胞重要的分化阶段；细胞开始衰老，原生质分布不均匀，出现液泡；开始积累糖原等内含物；产芽孢的菌开始形成芽孢；次生代谢产物（抗生素等）开始大量合成④菌体的最大收获期①稳定期如果及时采取措施，补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件（调整pH、温度、通气），可以获得更多的菌体物质或代谢产物。②对以收获菌体或与菌体生长相平行的代谢产物（SCP、乳酸等）为目的的发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期。③通过对稳定期到来原因的研究，促使了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。微生物在稳定期的生长规律对于生产实践的指导意义：4.衰亡期（Decline或Deathphase）营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。衰亡期特点：①生长速率常数R小于0；②细胞形态发生多形化

出现畸形或细胞大小悬殊；有些微生物因蛋白酶活力的增强而发生自溶，有些微生物产生或释放出一些代谢产物如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等；芽孢杆菌往往在此期释放芽孢。

该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。衰亡期在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线，但该法绘制的生长曲线不能反映衰亡期。二.丝状真菌的生长曲线丝状真菌是以菌丝干重（mg）作为衡量生长状况的纵坐标，时间为横坐标，绘制生长曲线。丝状真菌的生长曲线由三个时期组成：延滞期，快速生长期，衰亡期丝状真菌不是单细胞，其繁殖不以几何级数增加，故没有指数生长期三、同步生长（Synchronousgrowth）同步培养:使群体中的所有个体细胞处于同样细胞生长和分裂周期中（即大多数细胞能同时进行生长或分裂）的培养方法。通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。问题：如何研究在单个细胞的生理与遗传特性。通过同步培养方法的处理，非同步群体细胞处于同一生长阶段，并能同时进行分裂的生长状态，称为同步生长。同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。1.机械筛选法硝酸纤维素滤膜法（膜洗脱法，右图a）同步培养的方法有两类：离心法,右图b过滤法机械法优点：不影响菌体的代谢与活性，细胞保持自然状态。2.环境条件控制法环境环境控制法的缺点：细胞活性受到不同程度的影响。温度培养基成份其他光合细菌：光照和黑暗交替培养；芽孢菌：形成芽孢后加热处理四、连续培养(Continousculture）分批培养（batchculture）封闭培养（closedculture）培养基一次加入，不予补充，不再更换连续培养(Continousculture）在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物生长处于平衡生长状态，能以恒定的生长速率生长的一种培养方法。若在一个开放的系统中(恒定容积的流动系统)培养微生物，培养过程中不断补充营养物质和以同样的速率移出培养物，是实现微生物连续培养的基本原则。培养系统中的细胞数量和营养状态恒定，即处于稳态。单细胞微生物的生长符合典型的生长曲线最简单的连续培养装置包括：培养室、无菌培养基储存器和调节流速的控制系统。连续培养的主要参数稀释率D（h-1）：即培养基每小时流过培养容器的体积数。D==培养基的流动速率培养室的容积FV无菌培养基储存器培养室调节流速的控制阀1.连续培养的类型根据控制培养基流入培养容器方式的不同可分两种类型：恒浊器连续培养和恒化器连续培养。A.恒浊培养系统B.恒化培养系统1.盛无菌培养基的容器2.控制流速阀3.培养室4.排出管5.光源6.光电池7.排出物恒浊器：根据培养室内微生物的生长密度，借光电控制系统来控制培养基的流速，以取得菌体密度高、生长速率恒定的微生物细胞的连续培养器。恒化器：培养基流速恒定，通过控制培养基中某一生长限制性底物的浓度来调节微生物的生长速率,使微生物维持恒定生长速率的连续培养装置。两种连续培养系统的比较装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用恒浊器菌体密度无限制生长因子不恒定最高菌体或与菌体相平行的代谢产物生产恒化器培养基流速有限制生长因子恒定低于最高速率不同生长速率的菌体实验室科研恒化器中的菌体浓度不由稀释率决定，而由生长限制性底物浓度决定。通过控制流速可得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物，微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。遗传学：突变株分离；生理学：不同条件下的代谢变化；生态学：模拟自然营养条件建立实验模型如果根据连续培养器串联的数目分，也可分为两种类型：单级连续培养多级连续培养适用于：代谢产物的产生速率与菌体生长