分子遗传学基础-基因工程概述（普通遗传学课件）

《遗传学》PCR扩增技术内容一二三四五聚合酶链式反应示意图PCR反应的条件PCR反应的温度循环周期PCR引物PCR技术的应用在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。

PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。聚合酶链式反应示意图一、聚合酶链式反应示意图PCR反应的温度循环周期二、PCR反应的温度循环周期PCR反应的温度循环周期二、PCR反应的温度循环周期三、PCR反应的条件PCR反应的条件PCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。其长度通常在15~30个核苷酸之间。简并引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。

四、PCR引物1、基因组克隆2、突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核酸序列。五、PCR技术的应用：在引物的5’端参入额外的DNA序列《遗传学》Ti质粒介导的整合转化程序内容一二三四Ti质粒致瘤的分子机制Ti质粒的结构与功能共整合转化程序T-DNA染色体整合机制Ti质粒的改造二元共整合转化程序一、Ti质粒的结构与功能几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，其根部致瘤特性是由一种革兰氏阴性土壤农杆菌细胞内的野生型Ti质粒介导所致的。Ti质粒的图谱整个质粒160-240kb，其中T-DNA12-24kb。tms

的编码产物负责：合成吲哚乙酸；tmr

的编码产物负责：合成植物分裂素；tmt

的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱。二、Ti质粒致瘤的分子机制(一)、损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸。

二、Ti质粒致瘤的分子机制（二）、它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。二、Ti质粒致瘤的分子机制（三）、vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物。二、Ti质粒致瘤的分子机制（四）、复合物转化植物根部细胞二、Ti质粒致瘤的分子机制三、T-DNA的染色体整合机制四、Ti质粒的改造（一）、除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；（二）、除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；（三）、除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；四、Ti质粒的改造（四）、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；（五）、安装植物细胞的筛选标记，如使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；（六）、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。五、共整合转化程序六、二元整合转化程序（一）、将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；（二）、重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；以上述重组农杆菌感染植物细胞。《遗传学》基因工程的酶学基础—限制性核酸内切酶内容一二三命名断裂方式定义一、定义定义：这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。寄主控制的限制与修饰现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的，一种是修饰的甲基转移酶，另一种是核酸内切限制酶。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解。二、命名限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自微生物的属名第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自微生物种名第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶。三、断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式：（一）粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。

Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’三、断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式：（二）平末端

两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。Sma15’CCCGGG3’

3’GGGCCC5’三、断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式：（三）同裂酶指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。（四）同尾酶指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。限制片断的末端连接作用：分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。分子内连接分子间连接《遗传学》基因工程研究的主要内容或步骤内容一二基因工程研究的主要内容或步骤基因工程的支撑技术1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；切2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；接一、基因工程研究的主要内容或步骤：3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；转4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；增一、基因工程研究的主要内容或步骤：5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；检6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。一、基因工程研究的主要内容或步骤一、基因工程研究的主要内容或步骤基因工程研究的基本技术路线基因工程流程图1、核酸凝胶电泳技术；2、核酸分子杂交技术；3、细菌转化转染技术；4、DNA序列分析技术；5、寡核苷酸合成技术；6、基因定点突变技术7、聚合酶链反应（PCR）技术。二、基因工程的支撑技术《遗传学》基因工程发展史内容一二三基因工程定义基因工程发展史一、基因工程定义也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。多利和它的孩子二、基因工程发展史（1）在40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。（2）在50年代揭示了DNA分子的双螺旋模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。（3）在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明了信息的流向和表达问题。（一）基因工程的准备阶段1、理论基础中心法则每个基因都被认为是编码着一种蛋白质分子，所以人们一直十分重视研究单基因的结构与功能的关系。怎样重复杂的DNA中分离单基因，以便能在体外研究其结构和功能的一系列问题，成为基因工程的关键所在。（1）20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA连接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。（2）70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技术问世。这两项技术，使DNA的结构分析问题得到了根本的解决。2、技术基础（3）1972年首次构建了一个重组DNA分子，并提出了体外重组的DNA分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效表达等问题。（4）在60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术，这对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应用于基因操作实验。2、技术基础二、基因工程发展史1973年Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，同时与S.Boyer合作，将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。此研究成果表明基因工程已正式问世；并说明了质粒分子可以作为基因克隆的载体能携带外源基因导入宿主细胞，也说明了真核生物的基因可以转移到原核生物细胞中并在其中实现功能表达。（二）基因工程问世二、基因工程发展史自基因工程问世以的这二十几年是基因工程迅速发展的阶段。如果说20世纪八九十年代是基因工程基础研究趋向成熟，那么二十一世纪将是基因工程应用研究的鼎盛时期。（三）基因工程的发展《遗传学》分子辅助育种的常见分子标记内容一二三分子标记育种的定义分子标记辅助育种需具备的基本条件常见分子标记分子标记辅助育种：利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。一、分子标记辅助育种定义由此可见，传统育种法和标记辅助选择法在本质上没有什么区别，但在选择效率和准确性方面，后者比前者大大提高。基因转移基因型选择基因转移相关的品种、亚种、种表型选择传统育种法:标记辅助选择:相关的品种、亚种、种相关的品种、亚种、种相关的品种、亚种、种三、分子标记辅助育种需具备的基本条件1、分子标记与目标基因共分离或紧密连锁；2、分子标记检测容易，重演性好；3、基本实验手段及计算机统计分析软件。RM49RM1861.8RM550.6RM1688.5MRG49243.3RM4161.7AC8878a1.7AC2823a0.3bel0.1AC2827a0.4RM38671.2MRG10041.60.0三、常见的分子标记（一）、RFLP标记1、定义：RFLP，即限制性片段长度多态性，是指用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切等位片段在长度上的差异。2、应用：（1）植物遗传连锁图的构建；（2）分子标记辅助选择；（3）遗传关系分析及数量遗传研究等。三、常见的分子标记3、该技术包括以下基本步骤：（1）DNA提取；（2）用DNA限制性内切酶消化；（3）凝胶电泳分离限制性片段；（4）将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；（5）用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的（6）DNA杂交（称Southern杂交）；（7）放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。三、常见的分子标记（二）、AFLP标记1、定义：即扩增片段长度多态性，是一种将RFLP与PCR相结合的分子标记。2、基本原理：其基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增，模板是连接双链人工接头的酶切片段，引物的结合部位是接头以及与之相连的酶切片段中的几个碱基序列。AFLP基本原理3、AFLP标记的特点：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）模板DNA用量少，而且对模板浓度的变化不敏感；（6）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。三、常见的分子标记（三）、SSR标记1、基本原理：SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。三、常见的分子标记尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。ATATATATATAT2ATATATATATATATATATATATATATATATAT13123PCR扩增微卫星多态性分析示意图三、常见的分子标记2、SSR标记的特点：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此 其开发有一定困难，费用也较高。《遗传学》基因工程在植物方面的应用内容一二三四五提高植物的抗虫性提高植物的抗病性提高植物的抗逆性改良植物的品质思考问题转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。一、提高植物的抗虫性二、提高植物的抗病性转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯三、提高植物的抗逆性四、改良植物的品质四、改良植物的品质四、改良植物的品质不会引起过敏的转基因大豆1、目前用于杀虫的转基因抗虫植物基因有哪些?2、抗病转基因植物所采用的基因，使用最多的是什么?3、使烟草、番茄的耐寒能力提高措施是什么?4、

大米、玉米、小麦中哪种必需氨基酸较少?举例说明科学家如何提高氨基酸的含量?五、思考问题？《遗传学》应用分子标记构建遗传图谱内容一二遗传作图基本原理—连锁分析构建分子遗传图谱的基本程序孟德尔独立分配规律的要点是：各种配子基因型的比率是相等的（如左图）；若出现亲本型配子的比率高于重组型配子，则说明基因间出现连锁（如右图）。一、遗传作图基本原理—连锁分析二、构建分子遗传图谱的基本程序1、亲本确定；2、构建遗传作图群体；3、筛选亲本间具有多态性的标记；4、检测群体中每个个体的标记型；5、分析数据，建立连锁群；6、确定连锁群所属的染色体；7、分子标记与目标基因共分离或紧密连锁。（一）、作图亲本的确定1、作图亲本的要求（1）亲本间必须有较远的亲缘关系，以保证亲本间有较高的遗传差异（遗传多态性）；但亲本间亲缘关系也不能太远，否则会影响F1的育性，难以建立足够大的群体，并且可能造成后代严重的偏分离现象，影响遗传作图的可靠性。（2）一般先挑选几个候选品种，随机选择一些探针或引物，对它们标记分析，然后根据分析结果，选择多态性较高的一对品种做为亲本。2、作物上建立遗传作图的群体（1）暂时性分离群体。

BC1（回交一代）和F2是最常用的遗传作图群体，其优点是容易建立，速度快。其中BC1由于直接反映了F1配子的分离比例，因而在连锁统计分析上具有比F