羟苯磺酸钙对斑马鱼胚胎血管新生的抑制作用及其机制

羟苯磺酸钙对斑马鱼胚胎血管新生的抑制作用及其机制

氨基丙烯酸（cad）具有调节和改善毛细血管渗透性和柔软性的作用，能改善糖尿病和非糖尿病患者的微血管病变。临床中，该药物主要用于治疗原发性静脉曲张和慢性静脉功能不全、静脉炎、血栓性综合征1材料和方法1.1flm1基因转导型实验所用斑马鱼为野生型AB品系VEGF-R2(Flk1）转基因型，购自国家斑马鱼资源中心。选用雌雄比例为1∶2的成年斑马鱼15尾（30～35周龄），全长40～50mm。1.2特效药CaD购买自中国食品药品检定研究院，DMSO配成母液保存。1.3卡因pcr、斑马鱼循环水养殖系统ms内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（VRI，货号S1119）购自SelleckChem公司；葡萄糖（上海生工，货号A600219）、无水乙醇（广试化工）、氢氧化钠（上海生工）、氯化钾（上海生工）、硫酸镁（上海生工）、磷酸二氢钠（上海生工）、磷酸二氢钾（上海生工）、碳酸氢钠、氯化钠（阿拉丁试剂）均为分析纯；三卡因（货号MS222）购自Sigma公司；逆转录试剂盒（Takara，大连）；荧光定量PCR试剂盒（Takara，大连）；普通PCR仪（杭州晶格）；斑马鱼循环水养殖系统；恒温培养箱（LRH-250Z型）购自广州瑞明仪器有限公司；体式荧光显微镜（ZOOMV16型）购自ZEISS公司；酶标仪（瑞士TECAN）；荧光定量PCR(ABI9700）；胚胎血管内皮生长因子（VEGF）、一氧化氮合酶（NOS)ELISA试剂盒（R&D公司）。1.4电导率、周期根据Brand等提出的方法配制斑马鱼繁育所需循环养殖水，水温（28.0±0.5）℃，pH值为7.0～7.2，电导率为500～650μS/cm，周期为14h/10h（光照/黑暗）。按照雌雄1∶2比例将斑马鱼进行配对产卵，受精后10min内置于干净无菌、含有亚甲蓝孵化水且直径10cm的培养皿上，使用培养液洗净鱼卵和杂物，然后用养殖水将受精卵清洗3次，再置于光照培养箱，温度28.5℃，14h/10h（光照/黑暗）。1.5斑马鱼胚胎体节血管指数cad筛选180个受精后2d的斑马鱼胚胎，置于12孔培养板中，每孔15个胚胎。通过预实验测出不同给药组的药物浓度，分为空白组、高糖组（130mmol/L葡萄糖），阳性药+高糖组和高糖+CaD30、60、90μg/mL组。其中阳性药物给予浓度为500ng/mLVRI2mL,CaD不同浓度组分别给予对应浓度CaD2mL，给药时间72h，每24小时更换暴露液。在体式显微镜下观测斑马鱼胚胎体节间血管指数。体节间血管指数=完整血管数×1+不完整血管数×0.5，斑马鱼胚胎镜下荧光点数=镜下转基因荧光蛋白Flk1数量。1.6斑马鱼胚胎毒性评估将240个于CaD安全给药浓度范围内筛选的受精后2d斑马鱼胚胎置于12孔板中，每孔20个，评估其最大非致死浓度（MNLD）和最小全致死浓度（MTLD）。1.7斑马鱼vegf、nos、缺乏基因序列的引物设计按照TRIZOL试剂说明书提取总RNA，逆转录具体步骤参照试剂盒说明书。根据PubMed查询斑马鱼VEGF、NOS、GAPDH基因序列，使用Primer6.0设计引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。PCR过程各检测样本的CT(thresholdcycle）值采用21.8采用elisa法检测53gf和nos蛋白收集胚胎，使用蛋白裂解液提取鱼苗蛋白，采用双抗体夹心ELISA法，操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。1.9统计方法采用SPSS25.0统计学软件进行数据处理与分析，连续型计量资料均符合正态分布，采用均数±标准差2结果2.1各组斑马鱼胚胎体节血管指数及镜下荧光浚第1次给药剂量20g、60g、ml的比较CAD对高糖诱导斑马鱼体内体节间血管指数的影响见图1（封三）。高糖组斑马鱼胚胎的体节间血管指数及镜下荧光点数显著高于空白组（P<0.01）。阳性药+高糖组及高糖+CaD90、60μg/mL组斑马鱼胚胎的体节间血管指数及镜下荧光点数低于高糖组（P<0.05）；高糖+CaD30μg/mL组斑马鱼胚胎的体节间血管指数及镜下荧光点数与高糖组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。对高糖+CaD30、60、90μg/mL组进行组间比较，发现随着CaD给药剂量的增加，斑马鱼胚胎体节间血管指数降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与高糖组相比，药物处理后各组斑马鱼胚胎的荧光点数呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。2.2vegf、nos的mrna表达水平高糖组的VEGF、NOS表达明显高于空白组（P<0.01）；阳性药+高糖组及高糖+CaD90、60μg/mL组VEGF、NOS的mRNA表达水平低于高糖组（P<0.05）。高糖+CaD30μg/mL组VEGF、NOS的mRNA表达水平与高糖组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。2.3糖对vegf、nos蛋白表达的影响高糖组的VEGF、NOS表达水平明显高于空白组（P<0.01）。阳性药+高糖组及高糖+CaD90、60μg/mL组的V