TPT对HL-60细胞增殖凋亡及其对核干细胞因子表达的影响

TPT对HL60细胞增殖凋亡及其对核干细胞因子表达的影响

王景张静王晋摘要：目的：拓扑替康对HL-60细胞增殖凋亡及其对核干细胞因子表达的影响；方法：运用流式细胞仪（FCM）技术—AnnexinVFITC分析法，计算出药物作用前后的细胞凋亡率。并通过运用原位酶标记技术检测细胞凋亡；采用westernboltting等方法检测NS基因及蛋白在HL-60白血病细胞中的表达。结果：流式细胞仪技术结果：0.4?mol/L的TPT作用36h后，检测细胞凋亡率是（16.48±2.17）%，与对照组（0.12±0.04）%相比，具有显著性差异（PKey：拓扑替康核干细胞因子影响：R73：A：1003-9082（2018）05-0-02拓扑替康（topotecan，TPT）以DNA拓扑异构酶Ⅰ（TopoⅠ）为作用靶点的半合成喜树碱（CPT）衍生物，是一种新药，呈水溶性，目前已广泛应用于多种实体瘤的治疗及试用于恶性血液系统疾病的治疗[1]，并取得较好疗效。研究发现拓扑替康就是一种TopoⅠ抑制剂，作用位点比较独特，拓扑异构酶是一种细胞核内酶，无多药耐药现象，有较好的选择性特点。核干细胞因子（NS）基因[2]是一个新基因，与增殖调控功能相关，在干细胞和肿瘤细胞中常见，是一种鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，存在于细胞核内，以三磷酸鸟苷（GTP）依赖的形式游动，主要作用是和细胞增殖相关。近年来岳保红[3]等人发现在早期多潜能状态时的细胞内核干细胞因子蛋白表达量大，如果细胞开始分化NS蛋白会表达量剧降且会很快不见。他们还发现NS蛋白参与细胞增值调控过程，提出了NS蛋白参与多种干细胞或者癌细胞自身不断更新的进度，并且使细胞停留在分化状态不再继续分化。一、材料与方法1.材料1.1细胞株人源性白血病细胞系HL-60细胞，由中国协和医科大学肿瘤研究所提供。1.2试剂TPT（注射用盐酸拓扑替康）2.方法2.1细胞培养采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2饱和湿度下的恒温箱中进行常规培养，平均2-3天换液一次，，正常情况下细胞生长悬浮成团，大小较均一，光滑圆润，细胞膜完整，生长状态良好，取2X106的细胞进行实验。2.2流式细胞仪测定细胞凋亡（1）收集药物作用组和对照组的细胞，离心，离心后按照AnnexinV-FITCKit说明书上面的步骤，分别对对这些细胞进行处理，处理后细胞收集一起离心。（2）洗涤细胞：用4℃的PBS对细胞洗涤2次，再用缓冲液加去离子水配成1：4的结合缓冲液稀释洗涤后的细胞。（3）取稀释的结合缓冲液250?l重新使细胞得到悬浮，并调整其终浓度为1×106/ml。（4）取上述处理好的细胞悬液100?l于流式细胞管中，依次加入5?lAnnexinV/FITC和碘化丙锭溶液10?l，碘化丙啶浓度为20?g/ml。（5）将上述混液振荡摇匀，然后室温下避光放置15min。（6）在反应管中加入400?lPBS，检测。（7）所获得数据均经Cellquest1.2软件详细分析。2.3凋亡的原位酶标记检测（1）阻断内源性过氧化物酶和细胞的通透：先进行细胞涂片处理，处理好的细胞涂片用PBS缓冲液冲洗细胞3次，小心冲洗，防止冲洗过程中细胞丢失。与阻断剂（0.3%H2O2甲醇溶液）室温放置30min。再用PBS冲洗3次，冲洗后与通透液一起在冰浴中冰浴2min。（2）取出EP管，PBS再次冲洗2次，保持样品周围干燥，滴加20?lTUNEL反应混合液，在湿盒中37℃温育60min。PBS冲洗3次。（3）保持样品周围干燥，加入转化剂-POD30-40?l，放置湿盒中温度为37℃下温浴30min。（4）取出EP管，再用PBS冲洗3次，向管内加入50-100?lDAB底物溶液，显微镜下仔细观察以控制显色反应时间。（5）PBS冲洗3次，进行脱水透明处理，并用中性树胶进行封片。（6）设立对照组：对照组：已经固定和通透的细胞样品中加入50?l标记溶液，以代替TUNEL反應混合物，其余步骤同上。（7）TUNEL检测的结果判定：以细胞核内出现棕黄色着色颗粒为阳性。显微镜下随机计数300个细胞，以出现阳性的细胞数量所占的比值作为TUNEL检测的阳性率结果，其计算方法如下：TUNEL阳性率=阳性细胞数/300×100%。对照组也用同样的计算方法计算。2.4Westernblotting检测NS蛋白2.4.1取生长状态良好的细胞5×106～1×107个/ml，弃去培养液，细胞用预冷的PBS进行洗涤两遍。2.4.2向每瓶细胞加4℃预冷的PBS3ml。平放并轻轻摇动1min，然后离心，弃去PBS缓冲液和培养液。并重复上述操作步骤两次，目的是能彻底的洗去培养液。然后将洗好的培养瓶放于冰上保持低温。2.4.3SDS电泳（一）清洗玻璃板，使其表面洁净透亮。（二）灌胶、上样1、将清洗后的两个玻璃板对齐后放入夹中，夹紧，遂垂直卡在两侧的架子上以备灌胶。2、室温下配制10%分离胶，在配置好的分离胶中加入TEMED，立即摇匀，摇匀后立即灌胶，不能久放，以免胶凝固。3、灌胶后判断分离胶凝固的标准是肉眼能看到水和胶之间有一条折射线形成。凝固后应再等待3min使其凝固充分，倾斜，弃去胶上面的上层液体，角落处可用吸水纸把水吸干。4、再配制质量分数为4%的浓缩胶，同分离胶的配置一样，加入TEMED后立即摇匀，摇匀后可灌胶。沿角落倾斜把浓缩胶倒入玻璃板之间灌满剩余部分，灌好后可把梳子插入浓缩胶中。此步骤应注意灌胶时胶中有气泡产生，因此使胶沿玻璃板流下可避免此种现象。插梳子应注意，梳子应水平插入，不可左倾或是右倾。浓缩胶充分凝固后，用两手捏住梳子的两头垂直向上用力轻轻拔出，若胶凝固不充分，拔出梳子时可把凝固胶损坏。5、冲洗浓缩胶，使梳子孔圆润光滑，然后放入电泳槽中，电泳槽内加足够的电泳液，要淹没浓缩胶，至少漫过内侧的小玻璃板。6、将提取好的组织蛋白放入洁净的EP管内，向其中加5×SDS上样缓冲液，稀释缓冲液使其终浓度为1×SDS。将此EP管放在水浴锅内，沸水煮5-10min，目的是使蛋白变性。7、准备上样。用微量枪贴壁吸取EP管内样品，将枪头插至加样孔内并缓慢加入样品。2.4.4电泳；转膜；封闭、显色；显影、定影2.5凝胶图象分析由上述步骤得到的胶片在扫描仪上扫描或用照相机进行拍照，并用凝胶图象处理系统分析膜上的目的蛋白的分子量和净光密度值。2.6统计学处理数据由上述实验所得的全部数据均采用SPSS10.0统计学软件进行统计学处理，数据均用均数±标准差（）的形式来表示。以α=0.05作为有无统计学意义的判断水准。二、结果1.流式细胞仪对HL-60细胞凋亡的检测结果0.4?mol/LTPT作用HL-60细胞36h后，经流式细胞仪测定HL-60细胞凋亡率（以三次重复实验数据以表示），药物组可明显引起细胞凋亡，凋亡率为（16.48±2.17）%，与对照组比较（0.12±0.04）%，具有显著性差异（P<0.01）（如表2和图4，5）.2.Westernblotting结果示0.4?mol/L的TPT作用HL-60细胞36小时后，NS蛋白在白血病HL-60细胞中表达量减少，与对照组相比，条带染色变细、变浅、变淡；经灰度分析，对照组的平均灰度为97%，药物组平均灰度为54%。说明通过拓扑替康作用后的HL-60细胞中在一定程度上抑制了NS蛋白的表达，使NS蛋白表达下调三、讨论拓扑替康是1996年在美国上市的半合成抗肿瘤新药，在临床上已开始使用，这种药物由SmithklineBeecham制药公司制造，供应于各地，它也是世界上第一个以拓扑异构酶Ⅰ为靶酶的抗肿瘤药物，也有国产的拓扑替康，价格也较进口便宜，但疗效较进口为差。本研究结果显示：通过流式细胞术和Westernblotting结果显示对照组（未用TPT作用组）经过0.4?mol/LTPT作用HL-60细胞36h后NS蛋白条带明显变浅变细，RT-PCR结果显示NS基因表达量较对照组下降，这些结果都表明TPT可以抑制白血病细胞中NS基因的表达，使之下调，推理之TPT通过抑制NS蛋白成为治疗白血病的机制之一也不为不可能。也有研究表明[4]，NS可能在细胞周期中干细胞和癌细胞穿越G2/M调控点的决定方面是一个特异性因子，由于它仅表达于干细胞和恶性肿瘤细胞中，而白血病既是干细胞疾病又是恶性肿瘤，因此在白血病细胞中研究NS基因和NS蛋白也比较合适，而TPT是Topo-Ⅰ的抑制剂，具有广谱抗肿瘤作用，其作用机制也并不十分完全明了，因此，TPT有可能通过下调NS基因而达到抗白血病作用可能为其作用机制之一。TPT可以通过抑制HL-60细胞中NS蛋白的表达，并且也可能是通过抑制NS基因的表达，使NS基因表达下调，从而导致细胞离开细胞增殖周期而不断发生分化，使白血病细胞發生凋亡而达到抗肿瘤作用。Reference[1]刘庭波，吕联煌.c-myc反义寡脱氧核苷酸诱导人髓系白血病细胞系HL-60细胞凋亡.中国实验血液学杂志，2001，9（1）：34-38[2]张志宏；刘思金；等；RNA干扰抑制膀胱肿瘤细胞BIU-87核干细胞因子基因表达对其增殖的影响[J]；中华泌尿外科杂志；2006，S1：28-29[3]岳保红，孙玲等.核干细胞因子基因在急性白