水产品添加剂的检测-护色剂的测定

硝酸盐的测定——分光光度法原理一试剂二仪器和设备三目录页分析步骤四注意事项六结果计算五一、原理

样品经沉淀蛋白质、去除脂肪后，得到提取液，将提取液通过镉柱，在pH9.6～9.7的氨缓冲液中，使其中的硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，然后利用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的总量，由总量减去还原前亚硝酸盐含量即为由硝酸盐还原产生的亚硝酸盐含量。再乘以换算系数，即得硝酸盐含量。——镉柱法在镉柱中，镉定量地将NO3-还原成NO2-

Cd十NO3-

→CdO十NO2-

镉柱经使用后用稀盐酸除去表面的氧化镉可重新使用

CdO十2HCl→CdCl2十H2O二、试剂（1）氨缓冲溶液（pH9.6～9.7）：量取20mL盐酸，加50mL水，混匀后加50mL氨水，并加水稀释至1000mL，混匀。（2）稀氨缓冲液：量取50mL氨缓冲溶液，加水稀释至500mL，混匀。（3）0.1mol/L盐酸溶液：量取5mL盐酸，加水稀释至600mL。（4）硝酸钠标准溶液：精密吸取0.1232g于110～120℃干燥恒重的硝酸钠，用水溶解转移至500mL容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于亚硝酸钠200μg。（5）硝酸钠标准使用液：临用时吸取硝酸钠标准溶液2.5mL置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于亚硝酸钠5μg。三、仪器和设备组织捣碎机分光光度计镉柱镉柱于500mL硫酸镉溶液中，投入足够的锌棒经3-4h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉淀;倾去上层清液，以水用倾泻法多次洗涤镉沉淀，然后移入组织捣碎机中，加500mL水捣散约2秒;用水将金属细粒洗至标准筛上，取20-40目之间的部分，置试剂瓶中，用水封盖保存备用。（1）海绵状镉的制备镉柱的制备（2）镉粒镀铜

将制得的镉粒置锥形瓶中，加足量的盐酸(2mol/L)浸没镉粒,振荡5min。倾去上层清液，以水用倾泻法多次洗涤镉粒。加入20g/L硫酸铜溶液(每克镉粒约需2.5mL),振荡1min,静置分层,倾去上层溶液后,立即用水冲洗镀铜镉粒(注意镉粒要始终用水浸没),直至冲洗的水中不再有铜沉淀。

先向镉柱底部压入1cm高的玻璃棉作垫，上置一小漏斗，将新制的海绵状镉带水加入柱内，边装边轻轻敲击，排除柱内空气，加镉粉至8-10cm高，上面用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗。（3）镉柱的装填当镉柱填装好后，先用25mL盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25mL，调节水流速度至3～5mL/min;镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。（4）镉柱的恢复镉柱每次使用完毕后，应先以25mL盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25mL，最后用水覆盖镉柱。（5）镉柱还原效率的测定吸取20mL硝酸钠标准溶液，加入5mL稀氨缓冲液，混匀后注入贮液漏斗，使其流经镉柱还原。取10mL还原后的溶液（相当于10ug亚硝酸钠）于50mL比色管中，按亚硝酸盐测定方法进行测定，根据标准曲线计算测得结果，计算还原率。还原效率应大于95%为符合要求。还原效率的计算：

ms

X=——×10010式中：

X——还原效率，%10——测定用溶液相当的亚硝酸盐的含量，ugms——测得亚硝酸盐的质量，ug四、分析步骤（1）样品处理

与亚硝酸盐测定相同。（2）亚硝酸钠标准曲线的绘制

与亚硝酸盐测定相同。（3）样品中亚硝酸钠总量的测定

①将硝酸盐还原成亚硝酸盐：取20mL样品处理液置于50mL烧杯中→加入5mL氨缓冲液→混匀→放入贮液漏斗→样液流经镉柱还原→收集流出液→加15mL水置换柱内留存的样液→全部收集液经镉柱再还原一次→收集流出液→定容于100mL容量瓶中。

②测定亚硝酸盐的总量：取10－20mL还原后的样液于50mL比色管中，以下按“盐酸萘乙二胺比色法”中“样品的测定”项进行，测定其吸光度，用标准曲线回归方程求出该样液的亚硝酸盐总含量。（4）样品中亚硝酸盐的测定取40mL经操作步骤1处理的样液于50mL比色管中，按“盐酸萘乙二胺比色法”中“样品的测定”项进行，测定其吸光度，用标准曲线回归方程求出亚硝酸盐含量。五、结果计算式中：X——样品中硝酸盐的含量，mg/kg；

m——样品质量，g；

m1——样品经镉柱还原后测得亚硝酸钠的含量，μg；

m2——直接测得亚硝酸钠的含量，μg；

V——测定时用经镉柱还原后样液的体积，mL；

1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数。六、注意事项

1、镉为自然界有害元素之一，在制作海绵镉或处理镉柱，不要弄到手和皮肤上，一旦接触应立即用水冲洗。另外在操作过程中的废液含大量的镉，故应经处理后再排放，以免造成环境污染。

2、镉柱的还原效能应经常检查，如维护得当，使用一年效能无显著变化。当样品连续检测时，可不必每次都洗涤镉柱，如果数小时内不用，则必须洗涤镉柱。亚硝酸盐的测定——分光光度法原理一试剂二仪器和设备三目录页分析步骤四注意事项六结果计算五一、原理样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，生成重氮化合物，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色颜料，在538nm波长下测定其吸光度与标准比较定量。本法最低检出限为0.0001g/kg。——盐酸萘乙二胺法其反应式如下：二、试剂

1）亚铁氰化钾溶液：称取106g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]，溶于水后稀释至1000mL。

2）乙酸锌溶液：称取220g乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加30mL冰乙酸溶于水，稀释至1000mL。

3）饱和硼砂溶液：称取5g硼酸钠[Na2B4O7

·10H2O]，溶于100mL热水中，冷却后备用。

4）4g/L对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%的盐酸中，避光保存。5）2g/L盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中，避光保存。

6）亚硝酸钠标准储备溶液：精密称取0.1000g在硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，用水溶解移入500mL容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液亚硝酸钠含量为200μg/mL。

7）亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液亚硝酸钠含量为5μg/mL。三、仪器和设备1天平:感量为0.1mg和1mg。2组织捣碎机。3超声波清洗器。4恒温干燥箱。5分光光度计。四、分析步骤原样→捣碎→取匀样加入硼砂液→沸水浴15分钟→加亚铁氰化钾溶液→加乙酸锌溶液（沉淀蛋白质）→定容→撇去脂肪层→过滤（弃去不溶物）→滤液待测说明：硼砂溶液是亚硝酸盐提取剂。亚铁氰化钾和乙酸锌溶液是蛋白质沉淀剂；（1）样品处理（2）测定

①亚硝酸钠标准曲线的绘制

以零管调节零点，测每个的吸光值（于538nm下，用2cm比色杯）绘制标准曲线，求出回归方程。

50mL比色管（编号）

1

2

3

4

5

6

7

895ug/mL亚硝酸钠mL0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.5

2.02.5

相当于亚硝酸钠ug0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

7.5

10.012.50.4%对氨基苯磺酸

2mL

摇匀静置

3~5分钟

0.2%盐酸萘乙二胺

1.0mL

加水

定容静置15分钟

15分钟

②样品测定

取40mL滤液于50mL容量瓶中→加入2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液→摇匀→静止3-5分钟后→加入1mL0.2%盐酸萘乙二胺溶液→定容→摇匀→静止15分钟后→在538nm波长下测定吸光度五、结果计算式中：X——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg；

m——样品质量，g；

m1——测定用样液中亚硝酸钠的含量，μg；

V1——样品处理液总体积，mL；

V2——比色时吸取样品处理液体积，mL。六、注意事项

1）显色时的pH值以1.9～3.0为宜，显色后稳定性与室温有关，一般认为显色温度为15～30℃，在20～30min内比色为好。

2）当样品中亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将生成的偶氮化合物氧化，使红色消失，对结果产生影响，可以采取先放入试剂，然后再滴加试液的方法，防止氧化。硝酸盐和亚硝酸盐的测定——离子色谱法原理一仪器和设备二分析步骤三目录页结果表述四硝酸盐和亚硝酸盐的作用与危害硝酸盐和亚硝酸盐是水产品加工中经常使用的护色剂，能够使水产品呈现良好的色泽。但过多地使用硝酸盐和亚硝酸盐对人体会产生毒害作用。硝酸盐不仅容易诱发糖尿病，对肾脏造成的损害也十分严重。另外，硝酸盐在酶和细菌的作用下，被还原成亚硝酸盐，进而与人体内的蛋白质类物质结合，生成致癌性极强的亚硝胺类物质。GB5009.33-2016食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定第一法：离子色谱法第二法：分光光度法（盐酸萘乙二胺法）一、原理试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。二、仪器和设备（1）离子色谱仪：包括电导检测器，配有抑制器，高容量阴离子交换柱，50μL定量环。（2）食物粉碎机。（3）超声波清洗器。（4）天平：感量为0.1mg和1mg（5）离心机：转速≥10000转/分钟，配5mL或10mL离心管。二、仪器和设备（6）0.22μm水性滤膜针头滤器。（7）净化柱：包括C18柱、Ag柱和Na柱或等效柱。（8）注射器：1.0mL和2.5mL。注：所有玻璃器皿使用前均需依次用2mol/L氢氧化钾和水分别浸泡4h，然后用水冲洗3次～5次，晾干备用。三、分析步骤（1）试样预处理：

用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆备用。（2）提取：称取试样匀浆5g（精确至0.01g），置于150mL具塞锥形瓶中,加入80mL水,超声提取30min,每隔5min振摇1次,保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5min,取出放置至室温,定量转移至100mL容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000转/分钟离心15min，上清液备用。（3）净化：取上述备用的上清液约15mL，通过0.22μm水性滤膜针头滤器、C18柱，弃去前面3mL，收集后面洗脱液待测。

（如果氯离子大于100mg/L，则需要依次通过针头滤器、C18柱、Ag柱和Na柱，弃去前面7mL），——（固相萃取法净化）（4）参考色谱条件①色谱柱：氢氧化物选择性，可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换柱，如DionexIonPacAS11-HC4mm×250mm（带IonPacAG11-HC型保护柱4mm×50mm），或