荞麦蜜改善酒精诱导的小鼠肝脏及肠道菌群的研究

荞麦蜜改善酒精诱导的小鼠肝脏及肠道菌群的研究

饮酒和健康是全世界人们关注的热点问题。长期或过度饮酒对身体有害。肝脏是酒精代谢的主要场所，长期或过量饮酒容易引起酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD),其发展进程依次为：酒精性脂肪肝(脂肪变性)、脂肪性肝炎、酒精性肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质，具有多种生物活性1材料和方法1.1试剂与仪器荞麦蜜，产地为阿尔泰，由武汉乐神三宝蜂业有限公司提供；Lieber-Decarli酒精液体鼠粮和Lieber-Decarli对照液体鼠粮购买于戴茨生物科技(无锡)有限公司；谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所；总胆固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(TG)试剂盒，浙江东瓯诊断产品有限公司；肝脏病理学切片，武汉市皮诺飞生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯或色谱纯。SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量(18±2)g,许可证号：SCXK(鄂)2017-0012。1.2仪器、检测方法HI96785蜂蜜色度测定仪，哈纳水环境工程(上海)有限公司；配有示差折光检测器的高效液相色谱仪，岛津20AD,日本岛津公司；Agilent7800ICP-MS,美国Agilent公司；全波长酶标仪，美国ThermoFisher公司；F6/10手持式高速匀浆机，上海净信实业发展有限公司；低温高速冷冻离心机，德国Ependoff公司；倒置荧光显微镜，日本尼康公司。1.3卜方特比色计比色法色度的测定采用SN/T0852-2012《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口蜂蜜检验规程》中专用的卜方特比色计比色法。用蒸馏水进行调零，将不含气泡的试样倒入卜方特(Pfund)比色槽内，以卜方特比色计进行比色读取色值后确定色泽，色值单位为mm。总酚含量的测定参照Folin-Ciocalteu比色法糖含量的测定参考文献矿物质元素的测定参考国家标准GB5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》。1.4动物实验方案动物模型参照Bertola等1.5小鼠体质量变化肝脏是酒精代谢的主要场所，过量饮酒会导致热量增加、摄食减少、代谢异常等情况，使得营养物质缺乏，加剧对肝脏的损伤，体质量和肝脏指数的变化在一定程度上可以反映肝脏的损伤程度。建立模型期间，每天记录小鼠体质量，计算各组小鼠体质量的变化量。解剖取出肝脏后，用预先冷却的生理盐水洗去血液，用滤纸吸干并称质量。肝脏指数按照公式(1)计算：肝脏指数=肝脏质量/小鼠体质量×100%(1)1.6生化指标及氧化应激指标ALT升高反映了肝细胞膜的损伤，AST升高表明肝细胞损伤到了细胞器，AST和ALT是反映肝损害和样品是否有保护肝损伤效果的最直接和最重要的指标。酒精性肝损伤的初期表现为酒精性脂肪肝，而TC和TG是评估脂肪肝发生风险和病情分度的重要指标，其中TG的关联度更高。活性氧自由基引发的氧化应激是多种肝损伤发生的共同病理生理基础，MDA、SOD指标可以反映机体脂质过氧化和氧化应激程度。血清AST、ALT活力、肝脏TC、TG含量、血清MDA含量、肝脏SOD活力等指标的测定参照试剂盒说明书进行。1.7切片病理学观察肝脏组织固定后，经过梯度乙醇脱水和石蜡包埋后用病理切片机进行切片，将切片再次经过梯度乙醇脱水、脱蜡后用苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察切片病理学形态。1.8微生物多样性分析：大鼠粪便肠道菌群与肝脏疾病的发生、发展有着紧密的联系。评估肠道菌群稳态通常分析其物种多样性和丰富度的变化、物种组成差异等。其中，1.9数据的显著性分析本研究数据采用SPSS软件进行统计学显著性分析，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),采用Duncan’s多重比较法检验数据的差异显著性。2结果与分析2.1荞麦蜜、葡萄糖的理化性质和含量蜂蜜的抗氧化活性与其组成成分相关，尤其是酚类化合物、矿物质等，因此对荞麦蜜中的主要相关成分进行了测定。荞麦蜜的色度值为150mm,为深色蜜。果糖和葡萄糖的含量为43.03和35.19g/100g,二者总和超过60g/100g,蔗糖未检测出，符合GB14963-2011对蜂蜜糖含量的规定。重要的是荞麦蜜的总酚含量高达(145.81±3.93)mg/100g,明显高于其他品种的蜂蜜2.2小麦蜜对肝脏疾病的影响是已知的小鼠体质量和肝脏指数的变化结果见图1。如图1A所示，与空白对照组相比，酒精的摄入使小鼠体质量显著减轻(2.3麦冬蜜对肝脏疾病的影响是ast小鼠血清中ALT和AST活力测定结果如图2所示。酒精模型组的ALT和AST活性明显高于空白对照组(2.4小麦蜜对酒精引起的肝脏损伤大鼠肝脏tg和tg的影响对肝脏中的TC和TG含量进行测定。由图3可知，持续的酒精饲喂导致小鼠肝脏中TC和TG水平显著升高(2.5小麦蜜对酒精引起的肝脏损伤大鼠mda和sod的影响MDA、SOD反映机体脂质过氧化和氧化应激程度，结果如图4所示。与空白对照组相比，酒精模型组的MDA值显著升高(2.6肝组织病理学检测各处理组肝脏病理学切片结果见图5,直观反映了各组小鼠肝脏损伤的情况。空白对照组(C)肝细胞结构完整，排列整齐，胞浆内无脂滴分布，无气球样变性和炎性浸润现象，肝组织无异常改变。在酒精模型组(M)很明显可以看出，胞浆内有大量脂滴分布，结构紊乱，表明酒精模型组肝脏脂肪变性严重。在使用荞麦蜜干预(B)后，可以观察到胞浆内脂滴明显减少，肝细胞较完整且肝细胞排列趋于正常，肝脏脂肪变性明显减轻，这表明荞麦蜜对酒精引起的肝脏脂肪变性有明显的改善作用，肝脏受到很好的保护。2.7大鼠肠道菌群的组成如图6所示，各组的测序深度均接近于1,且无显著性差异(2.8不同因素可导致关系失调如图7所示，3组样本聚为3类，空白对照组与酒精模型组完全分开，而同样给予酒精的样品干预组也与空白对照组分开，与酒精模型组也几乎分开，说明了空白对照组与酒精模型组和样品干预组的肠道菌群组成存在差异，而且酒精模型组与样品干预组的肠道菌群组成也存在差异。因此，酒精和荞麦蜜的摄入使小鼠肠道菌群的组成发生了改变。肠道菌群的各菌种间形成一种互相制约、互相依存的平衡关系，多种因素可导致其失调。通过对小鼠粪便肠道菌群进行不同水平上的物种组成分析，比较不同组之间的物种组成差异，门水平结果如图8和9所示。由图8可知，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)在门水平上主导肠道菌群的组成，占比90%左右，其次还包括Proteobacteria、Epsilonbacteraeota、Deferribacteres、Actinobacteria、Fusobacteria、Tenericutes、Spirochaetes等。由图9A～D可知：与空白对照组相比，酒精的摄入使厚壁菌门相对丰度增加了24.56%,拟杆菌门相对丰度下降了4.4%,Proteobacteria相对丰度下降了21.6%,厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)的比例升高了30.30%;而荞麦蜜的干预逆转了这一现象，与酒精模型组相比，荞麦蜜干预组厚壁菌门降低15.59%,拟杆菌门升高7.18%,二者的比值下降21.25%,并基本恢复到与空白对照组一致的水平。为进一步说明荞麦蜜的摄入是否对酒精引起的肠道菌群变化有改善作用，对属水平相对丰度排前36的菌属进行了差异分析(图10)。由图10可知，各组间微生物相对丰度存在差异。图11A～C中，各组中3讨论3.1小麦蜜对大鼠、肝脏指数和组织病理学的影响脂肪变性、体质量减轻是酒精性肝损伤发生的症状，在酒精肝损伤早期往往伴随着肝脏的肿大，从而使肝脏指数升高3.2大麦蜜对肝脏疾病的影响如肝脏疾病