肾脏病相关的免疫学检查陈旻课件

肾脏病相关的免疫学检查北大医院肾内科陈旻肾脏病相关的免疫学检查北大医院肾内科陈旻1主要内容ANCA抗GBM抗体免疫球蛋白补体主要内容ANCA2抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）

Anti-neutrophilCytoplasmicAutoantibodies抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）Anti-neutroph3概念

以中性粒细胞和单核细胞胞浆成份为特异性靶抗原的自身抗体可存在某些小血管炎病人血清中概念

以中性粒细胞和单核细胞胞浆成份为特异性靶抗原的自身抗体4背景

1982年Davies等首次报道1985年vanderWoude等发现ANCA和WG相关1987年Savage等发现ANCA和MPA相关1988年Falk和Jennette发现部分少免疫复合物 型节段坏死性肾小球肾炎血清可测到 ANCA背景1982年Davies等首次报道5小血管炎特点全身系统性疾病，缺乏特异临床表现，早期诊断有时比较困难；发病凶险，进展迅速，可出现肺出血和ARF，严重者危及生命。ARF：53.8%肺出血：24.4%小血管炎特点全身系统性疾病，缺乏特异临床表现，早期诊断有时比6我科的统计资料从发病到检测ANCA的时间（500例患者）：平均237.6天，中位数为60天1个月内确诊者：23.2%3个月内确诊者：47.2%1年以上确诊者：11.0%最长1例长达4年

ChenM,etal.PostgradMedJ2005,81,723-7我科的统计资料ChenM,etal.Postgrad7ANCA阳性小血管炎发生率西方国家最常见的自身免疫性疾病英国：发病率仅次于RA我国：不少见北京大学肾脏病研究所近8年共新诊断700例确诊的人数逐年增加ANCA阳性小血管炎发生率8发病率确实在增加？医生对该疾病的认识深入？发病率确实在增加？9ANCA意义ANCA是小血管炎的特异性血清诊断工具ANCA滴度变化与病情相关

诊断小血管炎判断活动性估计复发

ANCA意义ANCA是小血管炎的特异性血清诊断工具10系统性血管炎以血管壁的炎症和纤维素样坏死为病理特征的一组疾病（vasculitides）分类原发性和继发性原发性血管炎的分类 目前通用1994年ChapelHill血管炎命名分类

Jennetteetal.ArthritisRheum1994;37:187-192系统性血管炎以血管壁的炎症和纤维素样坏死为病理特征的一组疾病11血管的解剖分类大血管中等血管小血管（内脏血管）大动脉主动脉中动脉、小动脉微小动脉、毛细血管、小静脉血管的解剖分类中动脉、小动脉微小动脉、毛细血管、小静脉12肾脏病相关的免疫学检查陈旻ppt课件13肾脏病相关的免疫学检查陈旻ppt课件14系统性血管炎命名分类（ChapelHill，1994）大血管巨细胞（颞）动脉炎Takayasu动脉炎（高安病，大动脉炎）中血管结节性多动脉炎（经典型结节性多动脉炎）Kawasaki病（川崎病）小血管韦格纳肉芽肿病（Wegener’sgranulomatosis,WG）变应性肉芽肿性血管炎（Churg-Strausssyndrome,CSS）显微镜下型多血管炎（Microscopicpolyangiitis,MPA）过敏性紫癜原发性冷球蛋白血症性血管炎皮肤白细胞碎裂性血管炎

Jennetteetal.ArthritisRheum1994;37:187-192系统性血管炎命名分类（ChapelHill，1994）大15ANCA检测方法一、间接免疫荧光法

Indirectimmunofluorescence，IIF二、酶联免疫吸附

EnzymeLinkedImmunosorbanceAssay，ELISAANCA检测方法一、间接免疫荧光法16间接免疫荧光法最常用、经典，方法简便缺点：不易区分ANA，主观性间接免疫荧光法最常用、经典，方法简便17IIF多见两种荧光模式胞浆型cANCA

胞浆内呈粗大颗粒，不均匀分布，靶抗原主要为PR3IIF多见两种荧光模式胞浆型cANCA18 环核型pANCA

荧光沿细胞核周围成线状分布，靶抗原主要为MPO 环核型pANCA19肾脏病相关的免疫学检查陈旻ppt课件20肾脏病相关的免疫学检查陈旻ppt课件21应注意与ANA区别ANA阳性，特别是强阳性者，单独应用IIF检测ANCA是不可取的（需要结合ELISA）应注意与ANA区别ANA阳性，特别是强阳性者，单独应用IIF22ANCA检测方法二、酶联免疫吸附EnzymeLinkedImmunosorbanceAssay，

ELISA总抗原ELISA:嗜天青颗粒粗制品做抗原灵敏度、特异性稍差特异性抗原ELISA:

优点：可区分不同靶抗原

特异性好，灵敏度高，主要ANCA检测手段缺点：价格昂贵，抗原来源困难ANCA检测方法二、酶联免疫吸附23已知的ANCA靶抗原嗜天青颗粒特异性颗粒胞浆弹力蛋白酶（HLE）组蛋白酶G（CG）蛋白酶3（PR3）天青杀素（AZU）髓过氧化物酶（MPO）杀菌/通透性增高蛋白（BPI）防御素（DEF）溶菌酶葡萄糖醛酸酶乳铁蛋白（LF）溶菌酶催化酶

-烯醇酶已知的ANCA靶抗原嗜天青颗粒特异性颗粒胞浆弹力蛋白酶（HL24PR3cANCA的主要靶抗原抗PR3抗体相对特异性较高，主要用于诊断WG中性粒细胞嗜天青颗粒中被发现的第三个中性丝氨酸蛋白酶（前二个是HLE、CG）由228个氨基酸所组成，分子量29kD可以消化、降解不溶于水的弹力蛋白，还可以消化、降解某些微生物。PR3cANCA的主要靶抗原25髓过氧化物酶（MPO）

pANCA的主要靶抗原之一在中性粒细胞嗜天青颗粒中含量最为丰富，可以占到细胞干重的5％

MPO可以催化过氧化氢和卤素（Cl-）反应产生次氯酸，杀死吞噬的微生物。髓过氧化物酶（MPO）pANCA的主要靶抗原之一26杀菌/通透性增高蛋白（BPI）1995年由Zhao等人发现

中性粒细胞内最重要的G-菌的内源性抗生素

IIF法中不典型ANCA的靶抗原之一抗BPI抗体多见于慢性炎症性肺部疾病（特别是长期绿脓杆菌感染者）如囊性纤维化杀菌/通透性增高蛋白（BPI）1995年由Zhao等人发现27中性丝氨酸蛋白酶家族的其它成员

人白细胞弹力蛋白酶（HLE），组蛋白酶G（cathepsinG），PR3和天青杀素（azurocidin）消化、降解许多细胞外基质

杀菌、抑菌的能力

中性丝氨酸蛋白酶家族的其它成员人白细胞弹力蛋白酶（HLE）28其它乳铁蛋白防御素（defensins）和

-葡萄糖醛酸酶（

-glucoronidase） 等等其它乳铁蛋白29ANCA相关疾病

一、

原发系统性小血管炎韦格纳氏肉芽肿

WG显微镜下多血管炎

MPA过敏性肉芽肿性血管炎

CSSANCA相关坏死性新月体性肾小球肾炎NCGN

（原发性小血管炎的肾脏局限型）ANCA相关疾病

一、原发系统性小血管炎30ANCA相关疾病

二、其它过敏性紫癜结缔组织病：SLE、类风湿性关节炎炎症性肠病：溃疡性结肠炎、克隆病自身免疫性肝病、原发性硬化性胆管炎感染性疾病：囊性纤维化、寄生虫感染（溶组织阿 米巴、盘尾丝虫病）、病毒感染（HIV）药物：肼苯哒嗪、丙基硫氧嘧啶ANCA相关疾病

二、其它31抗原特异性ELISA、IIF和疾病的关系疾病靶抗原IIFWGPR3cANCAMPAMPOpANCACSSMPO及其它囊性纤维化BPI不典型cANCA药物（esp.PTU）多克隆反应pANCA为主SLECG、LFpANCA或不典型炎症性肠病尚不明确自身免疫性肝病感染类风湿性关节炎抗原特异性ELISA、IIF和疾病的关系疾病靶抗原IIFWG32C-ANCA/抗PR3抗体的临床意义

（欧洲14个中心的评估报告）敏感性特异性WGMPAiRPGNC-ANCA64%23%36%95%抗PR3抗体66%26%50%87%Hagenetal.KidneyInt1998;53:743C-ANCA/抗PR3抗体的临床意义

（欧洲14个中心的评估33P-ANCA/抗MPO抗体的临床意义

（欧洲14个中心的评估报告）敏感性特异性WGMPAiRPGNP-ANCA21%58%45%81%抗MPO抗体24%58%64%91%Hagenetal.KidneyInt1998;53:743P-ANCA/抗MPO抗体的临床意义

（欧洲14个中心的评估34C-ANCA和抗PR3抗体同时阳性用于诊断WG的敏感性为73%P-ANCA和抗MPO抗体同时阳性用于诊断MPA和iRPGN的敏感性分别为67%和82%特异性达99%Hagenetal.KidneyInt1998;53:743C-ANCA和抗PR3抗体同时阳性用于诊断WG的敏感性为7335总结ANCA是小血管炎的特异性血清学诊断工具，且有助于指导治疗，估计复发目前，只有anti-PR3和anti-MPO具有较明确的临床价值总结ANCA是小血管炎的特异性血清学诊断工具，且有助于指导治36抗肾小球基底膜抗体Anti-Glomerularbasementmembraneautoantibodies，Anti-GBM

抗肾小球基底膜抗体Anti-Glomerularbasem37

抗GBM抗体相关疾病

定义：是指在循环中或脏器中沉积了抗GBM抗体的 一组临床疾病临床分类：1急进性肾炎I型：抗GBM抗体阳性，无肺出血，新月体性肾小球肾炎2Goodpasture病：三联征—新月体性肾炎、肺出血、抗GBM抗体3抗GBM抗体阳性，临床表现较轻的肾小 球肾炎，无明显肾功损害抗GBM抗体相关疾病

定义：是指在循环中或脏器中沉积了抗G38急进性肾炎

rapidlyprogressiveglomerulonephritis临床征候群急性肾炎综合征短期内出现少尿或无尿肾功能迅速恶化病理表现多为新月体性肾炎（50%，50%）

急进性肾炎

rapidlyprogressivegl39新月体性肾炎

CrescenticGlomerulonephritis分型（根据免疫荧光病理分为三型）I型抗肾小球基底膜（GBM）抗体型

抗GBM抗体沿肾小球基底膜线样沉积II型免疫复合物型III型少免疫沉积型（pauci-immune)

未见或微量免疫复合物沉积

新月体性肾炎

CrescenticGlomerulonep40I型中合并ANCA（+）者为IV型，不合并ANCA者仍为I型III型中ANCA（-）者为V型，ANCA（+）者为III型在荧光病理的基础上根据血清学又可分为五型I型中合并ANCA（+）者为IV型，不合并ANCA者仍为I型41

新月体肾炎病理分型与抗GBM及ANCA

分型抗GBMANCA抗GBM抗体型IIV

+—

+

+免疫复合物型II

少免疫沉积型IIIV—

+——

新月体肾炎病理分型与抗GBM及ANCA分型42抗GBM抗体检测的重要性

预后凶险，早期血浆置换可有一定的疗效临床出现少尿无尿、Scr大于700umol/L、病理新月体大于85%则预后不良。抗GBM抗体检测的重要性预后凶险，早期血浆置换可有一定的疗43GBM抗原

3(IV)NC1（IV型胶原

3链非胶原1区）正常隐匿，环境或其它因素可诱使其暴露GBM抗原3(IV)NC1（IV型胶原3链非胶44抗GBM抗体检测方法

间接免疫荧光IIF正常人新鲜冰冻肾组织切片为底物，不易保存典型荧光：线条样沿GBM沉积敏感性、特异性不好，主观性抗GBM抗体检测方法间接免疫荧光IIF45抗GBM抗体检测方法

酶联免疫法

ELISA胶原酶消化后的可溶性人GBM的抗原 蛋白成分（包括IV型胶原

3链NC1区），易于保存敏感性、特异性较高，可达95%以上判定结果客观，可定量对疾病的诊断和疗效判定有很大意义

抗GBM抗体检测方法酶联免疫法

ELISA46IIF法

Ag加待测血清加二抗IIF法Ag47IIF法阴性血清阳性或待测血清IIF法阴性血清阳性或待测血清48IIF法玻片标记、标号PBS1:10稀释血清，每点加30ul（阳性、阴性、待测血清）湿盒中，室温，30’PBS洗3次，每次1’以上加PBS1：4稀释（二抗）荧光素标记羊抗人IgG20ul/点室温，30’PBS洗1分钟以上荧光显微镜下读片IIF法玻片标记、标号49肾脏病相关的免疫学检查陈旻ppt课件50抗原特异性ELISA法检测ANCA及抗GBM抗体

Ag加待测血清加二抗抗原特异性ELISA法检测ANCA及抗GBM抗体

51抗原特异性ELISA法检测ANCA及抗GBM抗体

+-12345678910Ag+Ag-

+阳性血清-阴性血清1-10待测血清抗原特异性ELISA法检测ANCA及抗GBM抗体

52方法

1.包被酶标板:抗原包被孔—PR3、MPO、GBM非抗原包被孔—碳酸盐缓冲液2.孵育：37ºC，60’3.

洗板：PBS/Tween202次，拍干4.一抗：血清1:50稀释（阳性、阴性、待 检）5.

孵育：37ºC，30’

方法1.包被酶标板:53方法

6.洗：PBS/Tween203次，拍干7.二抗：羊抗人IgG(HRP)1:2000稀释8.孵育：37ºC，30’8.洗：PBS/Tween203次，拍干9.底物缓冲液10.显色：37ºC，5~10分钟11.

终止反应：1M硫酸12.测OD值：

=490nm（酶标仪）

方法6.洗：PBS/Tween203次，拍干54数据处理

血清OD值:抗原包被孔平均OD值—非抗原包被 孔平均OD值建立回归曲线：阴性5%，阳性100%，算 出待检%正常值建立：50~100份正常人血清，分 别算出%，均值

3SD数据处理

血清OD值:55

%

100%

19%

5%

0.2X1.4OD%0.2X56我科正常值

抗MPO-ANCA23%抗PR3-ANCA17%抗GBM13%我科正常值

抗MPO-ANCA23%57送检要求

取3ml血，不抗凝，血清，病历摘要（详细） ANCA120元，GBM50元（注明联系电话）邮寄地址：北京西城区西什库大街8号北京大学第一医院肾内科邮编：100034联系人：许远，庞维电话2562送检要求取3ml血，不抗凝，血清，病历摘要（详细）58咨询、转病人或随访 （010）66551736 陈旻大夫——关于小血管炎 崔昭大夫——关于抗GBM抗体病

咨询、转病人或随访59免疫球蛋白免疫球蛋白60由浆细胞合成和分泌

单体的基本结构：两条轻链和两条重链重链类型：μ、γ、α