层析技术(纸层析、薄层层析、离子交换层析)实验报告

实验报告课程名称：指导老师：成绩：分子医学实验实验名称：同组学生姓名：、薄层层析、离子交换层析）层析技术（纸层析一、实验目的和要求（必填）三、主要仪器设备（必填）五、实验数据记录和处理七、讨论、心得二、实验内容和原理（必填）四、操作方法和实验步骤六、实验结果与分析（必填）纸层析法——转氨基作用验证一、实验目的和要求1、了解纸层析技术的基本原理。2、掌握纸层析法。二、实验内容和原理体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转移酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基移换作用。此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组是将谷氨酸与丙酮酸在肝匀浆中的谷氨酸-丙酮酸氨基转织中。本实验移酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基移换反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。其反应过程如下：由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。三、试剂、器材与实验材料试剂：1%谷氨酸钾溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.25%一碘醋酸钾溶液、5%HAc溶液、0.01mol/L,PH7.4磷酸缓1冲溶液、展开剂、0.1%丙氨酸溶液、0.1%谷氨酸钾溶液0.1%茚三酮乙醇溶液器材：烘箱、剪刀、镊子、天平、研钵、滴管、烧杯、恒温水浴箱、10cm*20cm层析滤纸、层析缸、喷雾器、电吹风机、15mm*100mm试管及试管架实验材料：小白鼠四、操作方法和实验步骤1、肝匀浆的制备取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死后，取出肝脏，经0.9%NaCl溶液洗去血污后，称取肝脏约1g，置研钵中加入玻璃砂少许(或用玻璃匀浆器研磨)，然后加0.01mol/L，pH=7.4磷酸缓冲溶液1ml磨成匀浆，之后再加入4ml磷酸缓冲液。2、转氨酶反应取短离心管2只编号(1、2)，各加肝匀浆10滴，先将2号管置沸水浴中5分钟。两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴，1%丙酮酸钠溶液10滴，0.25%一碘醋酸钾溶液5滴，同置40℃水浴中保温30分钟。取出，向两管各加5%HAc溶液2滴，再同置沸水浴中5分钟，冷却后离心(2000r/min，5min)，将上清液移入另外同样编号的1.5ml小塑料离心管中备用。3、层析验证在10cm×20cm滤纸上，距短边2.5cm处用铅笔轻轻画一线(原线)，在原线上，每隔1.5cm处用铅笔作记号，并在线下底边注明1、2、谷氨酸、丙氨酸记号。用毛细管分别吸取1号液、2号液在层析滤纸上点样，注意斑点不可太大，一般直径约0.3cm为宜，约5min等干后，在1、2号原点上，再重复点两次次(注意，不可调错)，然后分别点上谷氨酸、丙氨酸，作为对照，干后置层析缸中展开1.5～2h。（注意：点样处切勿浸入展开剂中。）取出滤纸晾干，喷以0.1%茚三酮乙醇溶液，电吹风吹干，观察层析出现的斑点并解释之。五、实验结果转氨基作用纸层析得到的斑块形状呈向外火舌状，上端尖锐下端较钝，略呈三角状。分析原因亦可能是抖动引起，流动相与固定相都容易受震动，产生上升时速度不匀。标准组3、4号分别为Glu和Ala，其中Glu层析出的点在下方，Ala在上方。1号对照组仅出现与谷氨酸高度相同的斑块，无丙氨酸。22号实验组出现两种高度的斑点，高度与分析：1号中酶沸水浴变性不能实现转氨基作用，结合1号出现Glu与Ala两块斑点，到验证。3、4号对应，说明Glu与Ala同时存在。转氨基作用得六、讨论1.点样三次，毛细管末端如果有破裂点样会有困难。2.点样处勿进入展开剂中，否则样品会溶解在展开集中，影响实验结果。3.不同组的层析板或纸不要有接触以免相互污染。4.纸层析法是以纸为载体的分配层析法。一般以滤纸纤维上吸附的水分为固定相，由水饱和的相对于纸层析也可以看作是溶质在固定相和流动相之间连续萃取的过程。如果混合物中的各种成分在溶剂之间的分配系数足够大，它们就得到分离。样品经层析后，常用比移值Rf(ratiooffronts)来表示各组分在层谱中的位置。Rf值与待分离物性质存在一定关系，在一定条件下是常数。5.纸的选择和溶剂的选择：Whatman1号滤纸常用于分析性的于大量物分离。但其分离效果较1号纸差；Whatman4号和5号滤纸用于快速分离，但斑点边缘不清。固定相流动的有机溶剂为流动相。因此，质的工作；较厚的Whatman3MM滤纸，最好用质的选择溶剂与选择滤纸主要凭经验，取决于要研究的对象，所选溶剂最好能使样品中混合物的Rf值介于0-1之间。另外，在一些特殊的分离过程中，PH也是重要的，许多溶剂因含有醋酸或氨水而具有强酸或强碱环境。6.茚三酮（茚三酮水化物）是一种强氧化剂，PH值在4-8之间，与所有的α-氨基酸反应呈紫色。该反应很灵敏，所以常用来检测层析谱上的氨基酸。此外，茚三酮与许多非氨基酸的含氮成分亦可以发生反应，这些化合物包括一级和二级脂肪族胺类，以及某些非芳香族含氮杂环化合物。亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色。薄层层析分离脂类一、实验目的和要求掌握薄层层析的方法。二、实验内容和原理薄层层析法是将固定相支持物均匀地铺在玻璃板上成为薄层，然后将要分析的样品点加到薄层上，用合适的溶剂展开而达到分离的目的。常用的固相支持物有硅胶、氧化铝、硅藻土、氢氧化钙、磷酸钙等；本实验以硅胶G作固定相。脂类硅胶薄层层析的基本原理主要是通过硅胶对不同的脂类物质具有不同的吸附能力。在展开剂（移动相）展开过程中脂类物质在两相之间重复进行吸附-解吸-再吸附-再解吸,使各种脂类物质随展开剂移行，结果，与固定相（硅胶）吸附能力弱的和/或在移动相中溶解度大的脂类物质随展开剂移行到较远的距离，而与固定相吸附能力强的和/或在移动相中溶解度小的脂类物质，在展开过程中移行慢，落在后面，这样展开一段时间后就可以将各种脂类物质彼此分离开来。3三、试剂与器材试剂：硅胶G、展开剂、胆固醇标准液、三磷酸甘油酯标准液、卵磷脂标准液、试样、显色剂、0.3%羧甲基纤维素器材：8cm*12cm玻片、研钵及杵、烘箱、层析用标准缸、喷雾器四、实验步骤1．层析薄板的制作称取硅胶G2g置研钵中加入0.3%羧甲基纤维素8mL，研匀后迅速倒在8cm×12cm玻片上，水平放置，可用杵稍加涂抹使硅胶在玻2．点样璃上分布均匀，放置到硅胶凝固后，置100℃烘箱中烘干备用。分别用毛细玻管吸取各种脂质的标准液及试样，在薄板的一端1.5cm高度处取间距为1cm点样三次，待溶剂蒸发后置于盛有展开剂的标本缸中，点样一端起点以下，浸入展开剂中。注意：点样处切勿浸入展开剂中。3.约半小时后，当展开剂上升至适当高度（接近薄板上端）将薄板取出电吹风吹干，喷以磷钼酸显色剂，再次吹干或烘箱烘干。比较各种脂质和试样所显斑点位置，作的距离（cm）／展开剂扩展前沿至原点的距离（cm）。图记录之，计算Rf值，即斑点中心至原点五、实验结果从左至右分别编号为1~5三个标准点：1~31：胆固醇，居于三者中间2：三油酸甘油酯，处在最上面3：卵磷脂，处于最下面，基本不动二个试样点：4~54：菜油，仅出现与2基本相平的点，说明有三油酸甘油酯5：卵黄，出现三个点，3点相平，。而上面2个点理论上应该是胆固醇从图中我们可5号点中的上面两最下面那个点与为卵磷脂和三油酸甘油酯。但是，以发现，个点相对另外两个点要高。编号1卵磷脂23450cm0cm胆固醇0.3cm三油酸甘油酯0.9cm1.5cm1．0cm1.1cm出现上述现象的原因：可能是由于5号样品点由于边缘效应或制版不均匀使得5号样品点跑得比较快或者由于样品点里多种因素影响了样品点内部的几个点的溶解度，从而影响了跑得速度，从而与标准点不一。同时，我们发现样品3,4中的点较大，可以得出样品中的成分浓度较大。4我们也发现，薄层上出现许多深色小点，怀疑是制板时厚度不匀或者是硅胶G的分布不均问题。展开剂前沿至原点的距离为11.6cmRf（卵磷脂）=0；Rf(胆固醇)=0.3/11.6=0.0259Rf(三油酸甘油酯)=1/11.6=0.0862由于很多因素，使得我们测出的Rf值与理论值相差甚远，但是我们能从图中看出，我们的分离效果还是不错的。六、讨论1.薄层层析技术特别适用于分离样品中含量很低的物质，其原理主要是吸附层析（亦包含分配作用）。用硅胶G作吸附剂的特点之一是含有一种粘合剂（本实验用石膏做作粘合剂），以便将硅胶更好地粘在玻璃板上，可用于上行或下行展层。2.以硅胶G为固定相的薄层层析可用于各种小分子化合物（如脂类、氨基酸、多肽、维生素、核苷酸、糖类、生物碱、酚类等）的分析、分离，而且几乎都以脂溶剂作流动相。这一技术对同分异构体的分离具有独到的用处。3.点样三次，毛细管末端如果有破裂点样会有困难。4.点样处勿进入展开剂中，否则样品会溶解在展开集中，影响实验结果。5.不同组的层析板或纸不要有接触以免相互污。染6.制板后放入80-100摄氏度的烘箱烘烤30min,目的是除去水分，这一过程称为活化。在活化时要尽量避免温度升高或降低，时间不宜过长，否则薄层容易脱落。从烘箱取板前必须关闭电源，待稍冷后小心取出，不要碰破薄层，还要防止灼伤。离子交换层析分离混合氨基酸一、实验目的和要求掌握离子交换层析法的原理和操作方法。二、实验内容和原理离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力的不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。氨基酸是两性电解质，每一种氨基酸都有它特定的等电点，各种氨基酸在pH小于其等电点的溶液中以阳离子的形式存在，可以与阳离子交换剂进行交换，再慢慢增液的pH，氨基酸将依照其等电点由小到大的顺序逐渐洗脱，此时分部收集各洗脱组分，即可将各种大洗脱氨基酸一一分离。本实验以天冬氨酸和精氨酸为例，利用磺酸型阳离子交换树脂将其从混合物中分离。天冬氨酸是酸性氨基酸，pI=2.98；精氨酸是碱性氨基酸，pI=10.76。根据其等电点，我们选择0.1M柠檬酸缓冲液（pH2.2），将它们都吸附在阳离子交换剂上，再用0.1M柠檬酸缓冲液（pH5.0）洗脱天冬氨酸，用0.1MNaOH溶液洗脱精氨酸。5三、试剂与器材试剂：磺酸型阳离子树脂、0.1M柠檬酸缓冲液（PH2.2)、混合氨基酸溶液、0.5M柠檬酸缓冲液(PH5.0)、0.1M柠檬酸缓冲液（PH5.0)、0.1MNaOH、2MNaOH、2MHCl、0.2%茚三酮溶液、0.2%酸性茚三酮溶液器材：层析柱、乳胶管、“再”形夹、玻璃纤维、橡皮塞、PH试纸、沸水浴、烧杯、试管及试管架四、实验步骤1．装柱取加入填料的层析柱一支，夹好“再”形夹，用铁丝将树脂悬液搅匀，使树脂内不残留气泡，树脂自由沉降后打开“再”形夹，缓慢放出液体，当液面慢慢降至树脂面时，关闭下端“再”形夹。（注意在整个操作过程中，应防止液面低于树脂面，当液面低于树脂面时，空气进入树脂内形成气泡)2.洗柱用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液5ml洗柱，洗柱快结时束调整流速为5滴/min（20滴为1ml）3.加样将混合氨基酸溶液0.2ml沿层析柱内壁缓缓加入，打开“再”形夹，使样品液缓缓流进柱床，流速为5滴/min。样品全部进入柱床后，用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液2ml，分两次先后加入洗柱。4．洗脱及分段收集用0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，边加洗脱液边收集，并调节流速至10滴/min，每管收集1ml。所有收集管分次用茚三酮反应检测氨基酸。5．洗脱及分段收集待第一个氨基酸被洗脱后，（茚三酮反应检测连续两管呈阴性），立即改用0.1MNaOH以同样流速及收集体积洗脱，并对各管收集液进行氨基酸检测。五、实验结果pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱茚三酮阳性的试管：14,15,16,17号;其中14,15,16号试管较深。1234567891011121314151617181920编号-------------+++++++--14-颜色0.1MNaOH洗脱茚三酮阳性的试管：7，，9号，颜色较深。1编号2345678910111213156-颜色-----+++------pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱茚三酮反应有颜色的试管：为天冬氨酸，其中14、15、16号中含量较多。由于第一次水浴时，我们发净，所以又多加了5支试管再次进行脱色，并加热看颜14、15、16、17号;其中14、15、16号试管较深。因此在这四支试管中洗脱下来的