小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离课件

小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离1小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离1基本概念所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。

包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大细胞、干细胞。2基本概念所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免33免疫细胞分离方法：根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS根据细胞理化性质：1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感4免疫细胞分离方法：4T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）5T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8-辅B细胞表面标志

SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。

6B细胞表面标志SmIg、Fc受体、补体受NK细胞表面标志

人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。7NK细胞表面标志人类NK细胞流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。

流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合，通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106细胞/h)的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%～99%，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。FACS8流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测荧光激活细胞分离仪分离法

9荧光激活细胞分离仪分离法9流式细胞分析仪10流式细胞分析仪10磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。MACS通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。11磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（1212

1313免疫磁珠法细胞分选过程14免疫磁珠法细胞分选过程14免疫磁珠细胞分选装置15免15全自动细胞分选系统16全自动细胞分选系统16

Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcellPBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。

密度梯度离心法17Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：密度梯度离心法不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093

粒细胞密度为1.092

单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090

18不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.09318不同细胞密度不同19不同细胞密度不同19用1.077±0.001的分层液可将细胞分离20用1.077±0.001的分层液可将细胞分离20密度梯度离心法离心后血浆单个核细胞（PBMC）粒细胞红细胞21密度梯度离心法离心后血浆单个核细胞（PBMC）粒细胞红细胞2实验五

小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离22实验五

小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离22胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠鼠龄越小，胸腺体积相对越大。小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形态，属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环驻入脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。解剖图23胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆盖在心脏前上方的白色组织。取脾脏实验步骤：（一）取小鼠脾脏：小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶液中浸泡3~5min；取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋膜组织。24取脾脏实验步骤：（一）取小鼠脾脏：24（二）制备单个核细胞悬液：将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中，以1500rpm离心10min。弃去上清，加ACK至2~3ml，轻轻吹打混匀并放置3~4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min；弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min；弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。实验步骤：25（二）制备单个核细胞悬液：实验步骤：25（三）计算细胞浓度将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数；计算细胞总数：细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）X104X稀释倍数。实验步骤：26（三）计算细胞浓度实验步骤：26计数池支持堤正面观侧面观支持堤支持堤计数池（0.1mm缝隙）1mm27计数池支持堤正面观侧面观支持堤支持堤计数池（0.1mm缝隙）计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则28计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对压线细胞细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。29细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。29红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%。白细胞计数时，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%。如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应先做红细胞计数稀释液要过滤，试管、计数板均清洁干燥，以免杂质、微粒等被误认为细胞。30红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要30实验步骤：（四）计算细胞活力50μl细胞悬液+50μl的0.2%苔盼兰溶液并混匀；显微镜下观察，如果细胞被染成蓝色，旋转显微镜微调节钮，细胞无反光，则为死亡；而细胞不被染色，晶莹透亮，旋转显微镜调节钮，细胞明显反光而且有立体感，为活细胞；计算细胞活力：计数200个细胞中活细胞的