荧光分光光度法课件

第三章荧光分光光度法

(FluorescenceSpectrophotometry)1/73（5）荧光熄灭荧光分子与溶剂分子或其他溶质分子互相作用引发荧光强度减少现象称为荧光熄灭。这些引发荧光强度减少物质称为熄灭剂。

2/73造成荧光熄灭作用主要类型:（a）碰撞熄灭：碰撞熄灭是荧光熄灭主要原因。它是指处于单重激发态荧光分子M*与熄灭剂Q发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生熄灭作用。

3/73碰撞熄灭定量方程：F0/F-1=k[Q]上式称为Stern-Volmer方程式。式中：k为熄灭常数；[Q]为熄灭剂浓度，单位mol/L；F0、F分别为熄灭剂不存在时和存在时，溶液荧光强度。4/73

）k与体系粘度有关系，粘度越大，k越小；

）k与体系温度有关系，温度升高，k也升高；温度每升高1

C，k值增加在2%下列；

）熄灭剂浓度[Q]不得大于10mol/L。5/73（b）组成化合物熄灭有些荧光熄灭现象不能用碰撞熄灭理论来解释。

例如：某些荧光物质溶液在加入某些熄灭剂之后，（*）溶液吸取光谱有了显著变化，（*）溶液荧光强度显著减少。（*）荧光强度伴随温度升高而增强。以上几个情况都是由于组成化合物熄灭所致。6/73上述情况也许是：

络合M（有荧光）+Q

MQ（无荧光）

分解T

，MQ

M

+Q（荧光增强）

7/73（c）转入三重线态（级）熄灭含溴化合物、碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某些杂环化合物，容易转入三重线级，溶液中绝大部分转入三重线级分子在一般温度下不发光，它们将多出能量消耗于它们与其他分子碰撞之中，因而引发荧光熄灭。

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溶液中溶解氧常对荧光产生熄灭作用。这也许是由于顺磁性氧分子与处于单重激发态荧光物质分子相作用，促进形成顺磁性三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致。

试验证明：O2熄灭作用，似乎是随溶剂介电常数减小而增加，因此O2在水溶液中熄灭作用较小，而在有机溶剂中熄灭作用较强。9/73（d）发生电子转移反应熄灭某些熄灭剂分子与荧光物质分子互相作用时，发生了电子转移反应，即氧化-还原反应，因而引发荧光熄灭。例：甲基兰荧光溶液被Fe2+熄灭D*+Fe2+

D-+Fe3+有荧光无荧光

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发生电子转移反应熄灭剂并不限于金属离子，I-，Br-，S2O32-等易于给出电子阴离子对奎宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生熄灭作用。11/73（e）荧光物质自熄灭荧光物质溶液浓度大于1g/L时，经常发生自熄灭现象，因此液态纯物质荧光一般都不强烈。此种熄灭原因：

）由于浓度大，分子碰撞几率大，因而引发能量损失大；

）溶液浓度过高，物质分子发生二聚体乃至多聚体，而这些多聚体不发光。

12/73（6）光散射光散射经常关系到一种试验敏捷度和再现性。实践中常遇到光散射包括溶液瑞利散射和拉曼散射、器壁散射及胶粒散射（丁铎尔散射）。

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当物质分子吸取了频率较低光能后，并不足使分子中电子跃迁到电子激发态，而只是上升到基态中较高振动能级上去，若在10-15~10-12s返回到原能级，此时辐射出和激发光相同波长光，称为瑞利散射。

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若返回到较原能级稍高或稍低振动能级上，辐射出较激发光稍长或稍短光，称为拉曼散射。15/73（7）表面吸附在稀溶液中（<1

g/mL），表面吸附尤为显著，尤其是有机溶剂，此吸附更为厉害。溶质经常吸附在瓶子、吸管和吸取池等壁上。芳香族化合物易吸附，并且所用溶剂极性越小，吸附就越大。在非极性溶剂中加一点极性溶剂，经常能够减少这种吸附损失。16/73

3.4荧光分析仪器、特点及注意事项１.荧光分析仪器17/73

由光源发出光，经第一单色器（激发单色器）后，得到所需要激发光波长。荧光物质被激发后，将向四周八方发射荧光，但为了消除入射光及散射光影响，荧光测定应在与激发光呈直角方向上进行。仪器中第二单色器称为荧光单色器。它作用是消除溶液中也许共存其他光线干扰，以取得所需要荧光。18/73(1)光源

光源应具有强度大，适用波长范围宽两个特点。常用光源有高压汞灯和氙弧灯。

高压汞灯常用在荧光计中，发射强度大而稳定，但不是连续光谱。高压汞灯平均寿命均为1500~3000h，荧光分析中常用是365nm、405nm和436nm三条谱线。

19/73氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强度大，可用于200~700nm波长范围。在200~400nm波段内，光谱强度几乎相等。但氙灯需要稳压电源以确保光源稳定。20/73

另外，高功率连续可调染料激光光源是一种新型荧光激发光源。

激光光源单色性好、强度大。脉冲激光光照射时间短，并可避免感光物质分解。

21/73(2)滤光片和单色器在荧光计中，一般采取激发滤光片和荧光滤光片作为激发光束和荧光辐射波长选择器。而大部分荧光光度计中最少选用一种，而经常是用两个光栅单色器，且均带有可调狭缝，以供选择合适通带。

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激发滤光片、激发单色器作用是让所选择激发光透过并照射于被测试样上；

荧光滤光片、发射单色器作用是把激发光所发生容器表面散射光、瑞利散射光和拉曼光以及溶液中杂质荧光滤去，让荧光物质发出荧光通过而照射到检测器上。

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分光荧光计入射狭缝及出射狭缝是用以控制通过波长谱带宽度及照射到测定试样上光能强度。测定目标不一样，能够选择不一样狭缝，以取得较好测定成果。24/73(3)试样池荧光分析用试样池需要用低荧光材料制成。常用石英为材料。试样池形状以散射光较小方形为宜。有荧光计附有恒温装置，便于控制温度。测定低温荧光时，在石英池外套上一种盛有液氮石英真空瓶，方便减少温度。25/73(4)检测器荧光强度比较弱，因此要求检测器有较高敏捷度。在荧光计中常用光电池或光电管检测。但在荧光分光光度计中常用光电倍增管检测。二极管阵列和电荷转移检测器也应用于荧光光度计，它们能够迅速地统计激发和发射光谱，尤其适用于与色谱法或电泳法联用技术上。另外，能够统计二维荧光光谱图。26/73

目前，设计许多荧光光度计具有不少新功能。采取双光束荧光分析装置，能够提升办法精度；采取凹面全息光栅大孔径异面光学系统，可减少杂散光影响，并使检测限达5pg/mL；27/73采取“辨别器”装置，能够识别暗电流而不予统计，以减少荧光信号噪音等。不少仪器中还配有累加、微分、偏振、流动注射和液相色谱联用装置等，大大扩展了荧光分析应用范围。28/73

光学纤维可在远离光源和检测器不一样区域中，进行几个荧光物质分析。它是通过光学纤维将激发光源发出辐射传输到待测试样，然后由同样光学纤维将发射荧光传输返回到检测器，进行测定。29/732.荧光分析特点及注意事项(1)荧光分析特点a.敏捷度高

分子荧光法敏捷度一般比分子吸取光谱法高几个数量级（测定下限为:0.1~0.001g/g）。30/73这是由于在荧光分析中，能够采取高强度光源和高敏捷度荧光检测系统，从而大大地提升了它分析敏捷度。而在分子吸取光谱法中，由于是测量入射光和透射光比率，因而采取提升光源强度措施不能提升分析敏捷度。31/73b.干扰少

由于多种分子在紫外-可见光区都能产生吸取，不过其中只有一部分分子能再发射荧光，因此分子荧光法固有干扰少。c.选择性强

由于荧光法不但可根据其特性发射（发射光谱），并且能够根据其特性吸取（激发光谱）来判定物质；而分光光度法只能根据被测物特性吸取谱来判定。32/73d.试样量少且办法简便

使用荧光微池用10

L试液即可。e.能同步提供较多物理参数

包括激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光总量、极值峰位、谱带宽度、量子产率、荧光寿命和荧光偏振等参数。33/73(2)注意事项a.溶剂和化学试剂

对于溶剂，一是选择要合适，二是要足够纯。在使用波段范围内，选用溶剂应无吸取才好；另外溶剂中也不应具有卤素、硝基化合物或重金属离子，不然会减少荧光强度。对于化学试剂，越纯越好。34/73b.荧光污染荧光污染源很多（如：活塞润滑油、橡皮塞和软木塞、去污粉、洗液、滤纸和微生物等）。试验器皿须用1:1HNO3浸泡二十四小时或煮沸，再用蒸馏水洗净，凉干备用。35/73

3.5荧光分析试验技术1.荧光计校正(1)敏捷度校正

荧光计敏捷度可用被测出最低信号来表达；或用某一标准荧光物质稀溶液在一定激发波长照射下，能发射出最低信噪比时荧光物质最低浓度来表达。36/73

荧光分光光度计敏捷度与三方面有关：（a）与仪器光源强度、单色器（包括透镜、反射镜等）性能、放大系统特性和光电倍增管敏捷度有关；（b）与所选用波长及狭缝宽度有关；（c）与空白溶剂拉曼散射光、激发光和杂质荧光有关。37/73

由于影响荧光计敏捷度原因很多，同一型号仪器，甚至同一台仪器，在不一样步间操作所测得成果也不尽相同。因而在每次测定期，在选定波长及狭缝宽度条件下，先用一种稳定荧光物质，配成浓度一致标准溶液进行校正（或称：标定），使每次所测得荧光强度调整到相同数值（50%或100%）。假如被测物质所产生荧光很稳定，本身就可作为标准溶液。38/73

从紫外区到可见区常用标准荧光物质有：酚（溶于甲醇）、吲哚（溶于乙醇）、奎宁（溶于0.05mol/LH2SO4溶液）及荧光素（溶于水或乙醇）等。最常用是硫酸奎宁，其产生荧光十分稳定。39/73(2)波长校正

荧光分光光度计波长刻度在出厂前一般都通过校正，但若仪器光学系统和检测器有所变动，或在较长时间使用后，或在主要部件更换之后，有必要用汞弧灯标准谱线对单色器波长刻度重新校正，尤其在精细分析工作中尤为主要。40/73(3)激发光谱和荧光光谱校正

用荧光分光光度计测得激发光谱或荧光光谱，往往是表观，不是真实。其原因很多：单色器波长刻度不够精确；拉曼散射光影响以及狭缝宽度较大等，但这些原因都可消除或得到校正。最主要是光源强度随波长而变，检测器响应与波长不成线性。41/73

当用单光束荧光分光光度计测定激发光谱和荧光光谱时，由于不用参比溶液作相对校正，影响尤其大。尤其是当峰波长处于检测器敏捷度曲线陡坡时，误差最显著。

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因此，先将每一波长光源强度调整到一致（用仪器附有校正设备），然后根据表观光谱上每一波长强度除以检测器对每一波长响应强度进行校正，以消除这种误差。校正办法常由于仪器不一样而不完全相同。

目前生产荧光分光光度计大多采取双光束光路，可用参比光束抵消光学误差。43/732.试验新技术(1)时间辨别技术

时间辨别发光光谱技术是基于不一样发光体发光衰减速率不一样，配备使用带时间延迟设备脉冲光源（闪光灯或激光器）和带有门控时间电路检测器件（见下列图），通过选定延迟时间td和门控时间tg，对发射单色器进行扫描，得届时间辨别发射光谱，从而实现对光谱重合但发光寿命不一样组分进行辨别和分别测定。44/73

或者固定激发与发射波长，对门控时间扫描，得到发光强度随时间衰减曲线，从而实现发光寿命测量。时间辨别技术还能利用不一样发光体形成速率不一样进行选择性测定。45/73(2)偏振和各向异性技术

在偏振光激发下，荧光体所发射荧光在空间取向强度不一样，即偏振光。荧光偏振和各向异性测定，即只需在荧光分光光度计激发和发射光路上分别加上起偏器和检偏器（统称偏振附件）。

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在

处荧光偏振P()和各向异性r()值可按如下公式计算：P(

)=[III(

)-GI

(

)]/[III(

)+GI

(

)]r(

)=[III(

)-GI

(

)]/[III(

)+2GI

(

)]

式中：III(

)和I

(

)分别是检测器取向平行和垂直于起偏器取向时在波长

处观测到荧光强度，G为校正因子，可试验测定。47/73

由于荧光偏振不但与荧光体分子形状、光选择性和荧光体吸光对偏振激发取向等内在原因有关，并且许多外界原因，如：环境粘度等都会影响和变化其偏振度，从而在生化领域中取得了广泛应用。

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荧光体偏振度与荧光体转动速度成反比这一特性，可用于荧光免疫分析。若采取脉冲偏振光激发荧光体，还能够进行荧光偏振及各向异性时间辨别测量。49/73（3）同步扫描技术

根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持关系，同步扫描技术可分为：固定波长差、固定能量差和可变角（可变波长）同步扫描。

50/73同步扫描技术具有使光谱简化，谱带窄化，提升辨别率，减少光谱重合，提升选择性和减少散射光影响等很多长处。这种光谱简化，虽然损失了其他光谱带所包括信息，对光谱学研究不利，不过对分析工作却十分有利，能够避免其他谱带存在所引发干扰，提升测量选择性。

51/73固定波长差同步扫描中，波长差选择直接影响到同步光谱形状、带宽和信号强度，从而提供了一种提升选择性途径。

目前，有关合适Δ

选择已有若干理论研究，但在实际应用中多根据详细发光体系通过试验加以选择。52/73固定能量差（Δ

）同步扫描也许克服0-0带跃迁非常弱甚至不显现情况，以及不一样组分对Δ

不一样要求所带来困难。有也许对同一类化合物（如：多环芳烃）只选择一种Δ

值用于整个光谱扫描。同步还能最大程度地减小瑞利散射和拉曼散射干扰。

53/73可变角同步扫描技术可深入提升测量选择性。54/73同步荧光分析办法应用:固定波长差同步荧光分析多环芳烃和生物大分子检测小分子与蛋白互相作用热力学研究固定能量差同步荧光分析多环芳烃检测55/73可变角同步荧光分析天然产物检测高背景体系中微量组分检测56/73(4)三维光谱

三维荧光光谱（亦称：总发光光谱或激发-发射矩阵图）技术与常规荧光分析主要区分是能取得激发波长和发射波长同步变化时荧光强度信息。三维荧光光谱有两种表达形式：等（强度）高线图（如下列图中带圈部分）和等角三维投影图。

等高线图易于取得更多信息和体现与常规荧光光谱和同步光谱关系。

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三维光谱技术能取得完整光谱信息，是一种很有价值光谱指纹技术。可在石油勘采中用于油气显示和矿源判定；在环境检测和法庭判证中用于类似可疑物鉴别；临床医学中用于癌细胞辅助诊断和不一样细菌表征和鉴别；另外，作为一种迅速检测技术，对化学反应多组分动力学研究具有独特长处。58/73

3.6荧光分析用途分子荧光分析，是测量试样溶液在光源辐射激发下产生荧光光谱及荧光强度，从而鉴别待测物质和测定其含量一种分子光谱分析办法，它事实上是一种利用光能激发分子发射光谱分析法。它在实际应用中主要用于微量物质定量分析。

59/73荧光法作为一种高敏捷度分析伎俩，被广泛地应用于各个领域。可用荧光法测定元素达70多种，可用荧光法测定有机化合物为数更多，最少在数百种以上。60/731.无机化合物荧光分析能发生分子荧光无机物很少，因此某些无机元素需与某些有机试剂生成荧光络合物后进行间接测定。较常采取荧光法测定元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg及某些稀土元素等。可测量约60多种元素，测定办法能够分为下列四种：61/73(1)荧光熄灭法：某些元素可用荧光熄灭法进行测定，这些元素离子从发生荧光其他金属—有机试剂络合物中夺取该有机试剂或金属离子以组成更稳定络合物或难溶化合物，从而造成荧光强度减少，由荧光强度减少程度来测定该元素含量。用该法测定元素有：F、Cl、S、Fe、Ag、Co和Ni等。62/73(2)催化荧光法：某些荧光反应进行非常迟缓，荧光薄弱，难于测定，但若有微量金属离子存在，可起催化作用，反应将大大加速，可由在给定期间内所测定荧光强度来定量该起催化作用金属离子，称为催化荧光法。用该法测定元素有Cu、Be、Fe、Co、Os及H2O2等，该办法敏捷度特高，有可达0.1ng/g。63/73(3)低温荧光法：测定元素有Cr、Nb、U、Te等（-196

C液氮温度下）。(4)固体表面荧光分析法（SFF)：是将待测组分吸附于固体物质表面上，然后进行荧光测定；测定元素有U、Ce、Sm、Eu、Tb、稀土元素及Sb、V等。64/732.有机化合物荧光分析

在有机化合物中，脂肪族化合物分子构造较简单，能产生荧光为数不多。芳香族化合物因有共轭不饱和体系，容易吸取光能，其中构造庞大而复杂化合物