浅谈组培苗的脱毒及应用

植物在生长过程中几乎都会受到病毒的侵染，尤其是无性繁殖的植物，病毒严重影响果树、蔬菜、花卉和树木等植物的生长发育，造成产量降低、品质下降，严重时甚至造成植物的死亡，给农业生产造成巨大的经济损失，全世界每年因病毒造成的经济损失中，粮食作物达200亿美元，经济作物达600亿美元[1]。第九次国际病毒委员会公布的病毒数量达到了2000多种，归属于6个目87个科19个亚科349个属。1植物病毒的传播方式及为害病毒的传播途径多种多种，如昆虫传播、土壤传播、机械传播、无性繁殖材料传播，甚至有些病毒可以通过种子传播。植物感染病毒之后主要表现为内部症状和外部症状2个方面：内部症状主要有组织病变坏死、茎部微管组织和叶部坏死、产生激素、引起组织增生或产生各种类型的内含体，植物正常的生理代谢受到干扰，叶绿素、花青素及激素等的产生受到改变；外部症状主要有变色、坏死、畸形等相应的异常症状。植物感染病毒造成的经济损失是比较大的，如葡萄的扇叶病毒可使葡萄每年减产10%～15%，非洲可可树的肿枝病可使产量减少50%以上，马铃薯的退化病毒可使产量减少50%～70%。对于观赏性的植物，病毒导致花朵变少变小，甚至畸形、变色，从而失去观赏价值。2植物脱毒的方式2.1茎尖分生组织培养脱毒1952年Morel等从感染花叶病毒和斑萎病毒的大丽花植株上切取茎尖分生组织进行培养，并获得脱毒苗。茎尖分生组织培养脱毒苗是利用了病毒在植物体内分布不均匀的特点，病毒主要通过微管组织进行转移，而茎尖不含有微管系统，茎尖中的叶原基能分泌生长素抑制病毒的增殖，所以茎尖几乎不含有病毒或病毒的浓度很低，通过剥离茎尖或根尖进行培养，可获得脱毒苗。剥去茎尖的大小是脱毒的关键，一般剥取0.1～1mm茎尖进行培养，茎尖太小难于成活，茎尖太大脱毒效果差。何新民等[2]对“红姑娘2号”甘薯进行培养和脱毒研究，结果表明，剥去茎尖0.3～0.5mm时，脱毒率为100%，当剥去茎尖0.6～0.8mm时，脱毒率为93.3%。因此，进行茎尖培养脱毒时，需要综合考虑，选取的茎尖既要达到脱毒的效果，又要能够获得无病毒植株，一般选取0.2～0.5mm、带有1～2个叶原基的茎尖进行培养。2.2热处理脱毒热处理脱毒又称为温热疗法，主要利用病毒和寄主对高热忍耐的差异，将植物材料置于高于正常温度的条件下，可使材料内部的病毒部分或全部钝化，而植物材料不受或很少受到伤害，从而脱除病毒。在热处理时，重要的影响因素是处理的温度和时间，在一般情况下，热处理的温度越高，时间越长，脱毒效果越好，但是植株成活率就越低。张慧华等[3]对东方百合综合脱毒技术的研究表明，随着热处理时间的增加，茎尖萌发率降低，愈伤组织的分化降低，处理20d后成活率明显下降，30d后茎尖基本死亡。不同植物、不同品种、不同病毒种类对高温的忍耐力是不一样的，如百合籽球于35℃左右温度下处理4周，可明显降低病毒含量[4]，刘卫平等[5]对带有X病毒和Y病毒的马铃薯品种“大西洋”采用35℃4h+31℃4h进行交替培养，脱除PVX的比例达到60.6%。但热处理存在脱毒时间长、脱毒不彻底、脱毒具有一定的局限性，一般只能脱除球状病毒和类菌质体等缺点。2.3热处理结合茎尖分生组织培养脱毒热处理结合茎尖分生组织培养脱毒主要是先将植物材料采用热处理的方法进行脱毒，然后再切取较大的茎尖进行培养；也可以先切取茎尖进行培养，然后再对试管苗进行热处理。该种脱毒方法既可缩短热处理的时间，提高植株的成活率，又可剥离较大的茎尖，提高脱毒效果。如1956年Thomson将感染X病毒、Y病毒的马铃薯放在暗处进行培养，用35℃处理7～28d，切取5mm的茎尖进行培养，获得了脱毒苗。宋瑞林等[6]采用这种方法脱除了切花菊中携带的番茄不育病毒。2.4微体嫁接脱毒微体嫁接脱毒是将嫁接技术和植物组织培养技术相结合的一种获得脱毒苗的方法，该方法主要用于木本植物。具体操作是在无菌条件下将0.1～0.2mm的茎尖分生组织作为接穗，嫁接到由组培方式获得的无菌砧木上，从而获得完整植株[7]。这种脱毒方法大大缩短了育苗周期，保持了木本的优良性状。目前这一脱毒方式在杏、苹果、柑橘、桉树、山茶等植物的脱毒中已获得成功。2.5愈伤组织培养脱毒愈伤组织脱毒的原理是诱导形成的愈伤组织细胞有些不带病毒，这是由于病毒在植物体内分布不均匀，病毒的复制速度赶不上细胞增殖的速度，或者在诱导和增殖愈伤组织过程中，细胞发生了变异，产生了抗体。刘文萍等[8]通过唐菖蒲的花蕾诱导产生的愈伤组织进行培养，发现脱除了TMV病毒，且脱毒率达到60%。目前通过这种方法获得脱毒苗已在马铃薯、大蒜、草莓、枸杞、唐菖蒲、老鹳草等植物中获得了成功[9]。3脱毒苗的检测通过上述脱毒方法获得的脱毒苗有没有脱除病毒，必须通过鉴定才能确定。最初人们主要采用观察法和指示植物法来判断植物是否脱除病毒，最近几十年人们一直在探索更加简便、快速、准确的检测方法，以满足科研、教研的需求。3.1直接观察法观察脱毒苗的生长情况，如果出现花叶、黄花、畸形、矮化丛生等典型症状，说明植株没有脱除病毒。如果苗子生长整齐一致，长势好，叶色浓绿，说明苗木不带木病毒。该种方法一般需要和其他检测方法结合起来，才能更好地检测植株是否携带病毒。3.2指示植物法1929年美国的植物病理学家Holmes发现，用感染TMV烟叶汁液与金刚砂混合，涂抹到健康的烟叶上，2～3d后烟叶上出现了坏死斑。由于病毒具有一定的专寄性，所以这种鉴定方法应根据不同的病毒选择合适的指示植物。同时这种鉴定方法也有一定的局限性，不能测定出病毒的浓度，只能测出相对感染力。3.3抗血清鉴定法该种方法主要利用含有病毒抗体的血清与植物病毒发生的血清反应。不同的病毒会产生特异性不同的抗血清，用特定病毒的抗血清鉴定病毒的种类，具有特异性强、检测速度快的优点，所以，抗血清鉴定法是鉴定植物病毒的有效方法之一。但是该种方法需要提前制备抗原，包括病叶的研磨、过滤、澄清和纯化等，以获取较高纯度的毒源；还需要制备相应的抗血清，包括动物的选择、饲养；并将相应的毒源注射到动物体内，一般分4～6次进行注射，最后一次注射10～14d后，采集血样，分离出相应的抗血清，与甘油等比例混合后放于-20℃低温条件下保存。由于目前还有很多植物病毒的抗血清没有制备出来，因此抗血清鉴定法有很大的局限性。3.4PCR检测技术PCR检测技术即聚合酶链式反应检测技术，是美国科学家Saiki和Mullis等在1985年创建的一种选择性体外扩增DNA和RNA技术。自1990年有报道采用PCR检测翠菊黄花病类菌原体之后。现在很多植物中病毒的检测也采用此种方法，如韩帅等[8]采用RT-PCR技术检测从汶川采集到的辣椒样本，结果显示样品果皮、部分种子及叶片受到TSWV和PMMoV感染。PCR检测技术的优点是能将微量的病毒快速扩增到可检测的数量，在病毒浓度很低或样品量很少的情况下，可采用该方法进行检测，同时该方法检测速度快、灵敏度高。但是PCR检测技术对模板的要求较高，在检测过程中会出现假阴性。3.5核酸杂交技术核酸杂交技术是20世纪70年代发展起来的新技术，广泛用于生命学科中，近年来核酸杂交技术被广泛应用到病毒、类病毒的检测、鉴定和分类中。核酸杂交技术是指具有同源性的2条核酸单链在一定的温度和等离子强度等条件下，经碱基互补配对形成稳定的杂合双链分子的过程。将一段人工合成的核酸单链以非放射性同位素如生物素、荧光素等加以标记制成探针，探针与待测样品进行杂交，经自显影后指示病毒的存在及浓度含量的高低。现在国内外已制备出很多植物病毒和类病毒的互补DNA探针，作为商品销售。我国利用这一技术对葡萄扇叶病毒和柑橘裂皮病毒进行研究，取得了重大的成就。3.6电子显微镜法电子显微镜可以直接观察植物体内是否存在病原菌，从而确定植物是否脱毒完全。同时电子显微镜也能直接观察到病毒生物大分子的亚基单位，了解病毒的大小、形状、结构及特征，并根据这些特征判断病毒属于哪种类型。如古训聪等[9]对海南黄灯笼辣椒种传病毒采用电子显微镜负染法进行检测，结果表明CMV能通过种子传播。谢礼等[10]选取蚕豆病叶做成超薄切片，用电子显微镜观察，结果发现蚕豆叶肉产生严重的病理变化、细胞线粒体增生、体积增大、性状畸形。观察法的优点是操作简单、省时，大多数病毒可通过制玻片进行观察；缺点是电子显微镜的价格昂贵，电子穿透能力低，操作技术不易掌握，如需要病毒浓度含量较高的组织，制备超薄切片技术难度高。4脱毒苗的保存与繁殖4.1脱毒苗的保存脱毒苗脱除了病毒，但其抗病性并没有增加，在自然条件下还容易受到病毒的侵染，因此要做好脱毒苗的保存。4.1.1隔离保存。植物病毒传播的途径主要是昆虫，据统计，现在大概有460多种昆虫能传播病毒，因此脱毒苗一般需要在隔离地种植保存，以防止再次感染。隔离网以35～60目的尼龙网为好，可防止蚜虫飞入。土壤要定期消毒，最好是没有种过该种植物。隔离地环境要保持清洁，定期喷洒杀虫剂，定期检测苗木，一旦发现染病植株，采取果断措施清除，避免病毒再次传播。4.1.2离体保存。除了隔离保存，还可以采用离体保存，离体保存是将脱毒苗保存在1～9℃低温、低光照条件下培养，在这样的环境条件下脱毒苗生长缓慢，继代周期可达半年至一年，甚至更长时间。这种保存方法成本低，保存时间长。4.2脱毒苗的繁殖经检测，不含病毒的苗子除了要保存还要进行无病毒苗的扩大繁殖，以满足生产上的需求。田间繁殖脱毒苗主要是将脱毒苗在防虫网室内进行繁殖成原种苗，原种苗再进一步扩大繁殖成良种，供生产上使用。脱毒苗在繁殖过程中要防止再次感染病毒传入，在移栽前，所使用的基质要进行消毒，防止土传病害，用于繁殖的所有器具、设施都要经过消毒才能使用，灌溉用的水要达到标准，一旦发现有病株或弱株，要及时拔除，以免病毒传播。5展望植物病毒是制约农作物产量和质量发展的主要因素之一，植物一旦感染了病毒，就没有化学药剂能够治愈，目前主要通过植物脱毒的方法获得脱毒苗。植物脱毒的方法有很多种，各有优缺点。植物脱毒效果的好坏不仅与植物脱毒的方法有关，还与病毒的种类、