泡盛曲霉sg1菌株ura3基因的诱导与鉴定

泡盛曲霉sg1菌株ura3基因的诱导与鉴定

作为一种主杆菌，蘑菇通常被用作外源基因的表达。因为它具有清晰的遗传背景、多种分子克隆载体、简单的基因操作等优点。但由于大肠杆菌表达外源基因的产物不易分泌到胞外,这就使表达产物的分离纯化增加了难度。此外,大肠杆菌表达的有些外源基因产物缺乏生物学活性,因而人们把注意力集中到了真核生物。在过去的十年中,曲霉属中的米曲霉、黑曲霉以及其变种泡盛曲霉作为宿主菌已成功地表达了多种外源蛋白质,有的外源蛋白质的表达达到了较高水平当我们把几株来自泡盛曲霉的糖化酶高产菌株与实验室菌株进行相关分子生物学比较时,发现其中一株糖化酶高产菌SG1具备如下特点:一是该菌株生长速度快,糖化酶基因转录和翻译作用均具有高效性,且分泌功能强;二是该菌株不产生胞外水解蛋白酶,这就使外源蛋白质分泌到胞外时能稳定地保留于培养基中而不被降解,从而间接提高表达水平;三是该菌株的培养基可用廉价的淀粉物质,因而具有经济性。此外,该菌株还具有食用级安全性。根据以上特点,我们选择该SG1菌株作为出发菌,经过紫外线诱变获得了稳定的抗FOA突变株。以含野生型URA3基因的质粒对突变体作转化,选择Ura1材料和方法1.1限制内切酶及随机引物Novozyme234,5-氟乳清酸(FOA)由Dr.DavidArcher赠送,其它限制性内切酶以及随机引物均购自美国BRL公司和德国格尔曼海姆中国有限公司。(α-1.2细菌和颗粒黑曲霉变种泡盛曲霉SG来自于经过多次诱变筛选获得的糖化酶高产菌株。质粒载体pIGPYRG提供黑曲霉野生型URA3基因1.3培养基用于黑曲霉培养和转化的培养基有基本培养基和YG培养基1.4总rna提取包括质粒的提取、大肠杆菌的转化、DNA的凝胶电泳、Southern杂交、Northern杂交和黑曲霉变种泡盛曲霉的总RNA提取均参照分子克隆手册的标准方法进行操作1.5抗foa单菌落的纯化根据出发菌株分生孢子的紫外线致死曲线,选择其死亡率为85%～90%的诱变时间诱变分生孢子,然后把诱变的分生孢子涂布在含FOA(1mg/L)和尿嘧啶核苷(10mmol/L)的基本培养基上,在30℃条件下培养7～10d,挑选出能够抗FOA的单菌落后,进一步纯化抗FOA的单菌落。最后检测突变株的回复突变率。1.6原生质体的制备和转化萌发分生孢子制备原生质体及PEG介导的原生质体转化法参照文献[6]。2结果2.1菌株接种的培养首先制作泡盛曲霉SG1分生孢子的死亡曲线,然后按死亡率为85%～90%的诱变时间诱变分生孢子,再将诱变的分生孢子涂布于含FOA和尿嘧啶核苷的基本培养基上避光培养。7～10d后平板上只出现一些生长速度慢的小菌落,把这些小菌落分别同时接种到基本培养基和含尿嘧淀的基本培养基上培养。结果有13个菌落在基本培养基上不生长,而在含尿嘧啶的基本培养基上能生长,再把这13个菌落的分生孢子分别接种于基本培养基和含尿嘧啶的基本培养基上培养,用这种方法重复3次筛选,最后获得了13个稳定的抗FOA突变株。为了进一步确定突变株的稳定性,分别把这些突变株的孢子悬浮液经过无菌蒸馏水洗涤5次后,再涂布于基本培养基上培养(每个平板有102.2rt-pcr检测突变株的鉴定由于不同真菌的抗FOA突变株发生突变的基因可能是URA3基因,也可能是URA5基因为了进一步研究这些突变株中URA3基因突变可能造成该基团不能进行正常转录或翻译,提取这些突变株的总RNA,用URA3基因作探针进行Northern杂交。结果表明,这5株突变株的总RNA均不能与URA3基因发生杂交(图1第1～5道),只有出发菌株的总RNA能与URA3基因发生杂交(图1第6道)。为了证实上述结果的可靠性,我们以URA3基因编码区片段(外显子)核苷酸顺序作为设计引物的根据(引物顺序为:上游引物5′-GTACGCCTCCCAACCTTCCT-3′;下游引物5′-ACTGCAGCATCCTGCCTGGC-3′),然后做RT-PCR反应,结果也只有出发菌株及相关转化子的总RNA能扩增出大小为456bp大小的DNA片段。这说明5株突变株的URA3基因突变可能均发生在影响转录的相关位点。2.3ura3基因质粒的转化为了进一步证明上述突变株是URA3基因而不是URA5基因突变,我们用来自含黑曲霉的野生型URA3基因的质粒pIGPYRG转化突变株SA5。结果是含野生型URA5基因质粒不仅能转化泡盛曲霉SA5突变株为原养型,而且其转化频率为50个转化子/μgDNA。用黑曲霉URA3基因的XbaI片段(3.8kb)作探针分别与出发菌株SG1、突变株SA5以及SA5Ura3ura3基因转录作用及与外源基因整合采用营养缺陷型作为转化的选择标记比采用抗生素作为选择标记的表达系统在生产上更具优越性因为大规模生产外源蛋白质若用抗生素作为选择标记则增加成本和带来安全性问题,若用营养缺陷型作为选择标记,可克服上述缺点。选择URA3基因作为选择标记基因可以使外源基因整合在URA3基因位点处在嘧啶的生物合成途径中,酵母和丝状真菌以及高等动物细胞通常是从谷氨酰胺开始经过六个酶促反应步骤合成5-磷酸尿嘧啶核苷(UMP)后,再转化生成UTP和CTP。在酵母细胞中,编码这六种酶的基因分别为URA2-C、URA3-B、URA4、URA1、URA5和URA3基因Northern杂交及RT-PCR分析表明URA3基因突变导致该基因转录功能丢失,这可能是由