双孢菇中酪氨酸酶的提取与分离

双孢菇中酪氨酸酶的提取与分离

双唑菌是世界上最常见、产量最高的细菌。它在中国各地都种植，是中国产量最高的蘑菇。酪氨酸酶（TYR）又称儿茶酚氧化酶、多酚氧化酶等试验采用丙酮沉淀，硫酸铵盐溶盐析和透析、反渗透相结合的方法提取双孢菇中的酪氨酸酶并部分纯化，研究酶学性质，为双孢菇采后保鲜、防止褐变、延长货架期提供依据，同时为美白和乌发化妆品的开发提供参考。1材料和方法1.1试剂及仪器双孢菇（郑州毛庄菜市场）。丙酮（AR级，安徽宿州化学试剂厂）；硫酸铵（AR级，新乡市化学试剂厂）；氟化钠（AR级，莱阳化工实验厂）；磷酸氢二钠（AR级，北京红星化工厂）；磷酸二氢钾（AR级，莱阳化工实验厂）。1.2f-c型，高速板式离心紫外分光光度计（SP-2102PC型，上海光谱仪器有限公司）；三用紫外分析仪ZF-C型（上海康禾光电仪器有限公司）；高速台式离心机（TGL-18C型，上海安亨科学仪器厂）；离心沉淀器（80-1型，上海手术器械厂）；组织匀浆机（JJ-2型，金坛市亿通电子有限公司）；高速冷冻离心机（GL型，湖南仪器仪表总厂离心机厂）。1.3测试方法1.3.1酪氨酸酶液的提取双孢菇清洗，去水，切块，按照1︰1比例加入pH6.8磷酸缓冲液，组织匀浆至浆状，4℃，5000r/min离心15min，弃沉淀，上清液即为粗酪氨酸酶液。粗酶液加等体积丙酮沉淀，同上述条件离心，弃上清，加10%饱和(NH1.3.2对酪氨酸酶活性的测定参照马庆一等1.3.3关于氨基丙烯酸的研究1酪氨酸酶活力测定测定不同底物浓度下反应速度随时间的变化。分别取2.0,1.5,1.0,0.8,0.5和0.1mL含2mmol/LL-酪氨酸（底物）的pH6.8磷酸盐缓冲液，加pH6.8的磷酸缓冲液使总体积均为4mL，加入0.02mL酪氨酸酶液，按1.3.2小节在317nm比色测定酶活力。2酪氨酸酶活性的测定分别取4mLpH3～8.510种pH的磷酸盐缓冲液（含1mmol/LL-酪氨酸），25℃保温10min后，立即加入0.02mL酪氨酸酶液，按1.3.2小节在317nm比色测定酪氨酸酶的活性。3酪氨酸酶活性的测定反应体系为4mL含1mmol/LL-酪氨酸的pH6.8磷酸盐缓冲液，在5～60℃不同温度的水浴中保温10min后，立即加入0.02mL纯化后酶液，混匀后按1.3.2小节在317nm测定酪氨酸酶活性。4异vc钠对酶活性的影响以4mL含1mmol/LL-酪氨酸的pH6.8磷酸盐缓冲液为底物，分别测定无抑制剂、加入0.01%异VC钠时酶反应速度随时间的变化，绘制酶反应速度曲线，比较抑制剂对酶活性的影响。2结果与讨论2.1提取过程的影响缓冲溶液粗提应在0～4℃下进行，以防止酪氨酸酶失活，缓冲溶液中加入0.1mol/LNaF，以抑制提取过程中酶促反应的进行，防止褐变的发生，避免酶失活。采用丙酮沉淀酪氨酸酶，整个操作过程控制在0～4℃下进行。2.2蛋白质含量变化粗酶、初步纯化酶液和纯化后酪氨酸酶的酶活力、蛋白含量、比活力和纯化倍数如表1所示。结果表明，在提纯过程中，第一步经过丙酮沉淀和硫酸铵盐溶，酶活提高5倍，而蛋白质含量却下降近1/2。第二步经过60%饱和硫酸铵盐析，在蛋白质含量没有明显提高情况下，酶活提高近70倍，比酶活提高500余倍，说明经过丙酮沉淀和硫酸铵盐溶，去除部分杂蛋白。试验中盐溶用10%饱和硫酸铵溶液，盐析中硫酸铵用量60%的饱和度，结果证明这样可有效去除杂蛋白，纯化效果明显。2.3氨基酸酶的性质2.3.1底物浓度对酶活的影响根据酶活随底物浓度的变化值，绘制出不同底物浓度酶反应速度曲线，结果如图1所示。结果表明，底物与酶活呈典型的矩形双曲线，当底物浓度小于0.4mmol/L时，为一级反应，反应速率和底物浓度呈正比；当底物浓度大于0.804mmol/L时，反应速率趋近最大反应速率，接近零级反应，反应速率不再随着底物浓度增加而增加。反应动力学符合米氏动力学方程。2.3.2纵坐标实验结果采用双倒数作图法，以1/[s]为横坐标，以1/V纵坐标作图，结果如图2所示。由图2得出的线性方程y=0.0131x+0.0241可知，直线在y轴上的截距为1/V2.3.3同ph时酪氨酸酶的变化在不同pH条件下，在317nm处吸光度随时间变化结果，以pH为横坐标，不同pH时的酶活为纵坐标作图，结果见图3。酪氨酸酶的最适pH为6.5，其在pH6.5附近保持较高的活性，在pH6.5以下酶活力与pH呈正相关关系；在pH6.5时达到最大值；大于pH6.5时，酶活力与pH呈负相关关系。2.3.4不同温度时，不同温度对产酶的影响不同温度时，在317nm处吸光度随时间变化结果，以温度为横坐标，不同温度时的酶活为纵坐标作图，结果见图4。酪氨酸酶最适温度为30℃，其在30℃左右保持较高酶活力，温度对酶活的影响呈“钟罩形”曲线。2.3.5测定不同时间的吸光度异VC及对照在317nm处吸光度随时间变化结果，以时间为横坐标，不同时间的吸光度为纵坐标作图，结果见图5。异VC钠是常用抗褐变剂，它能有效地抑制酪氨酸酶活性，使反应速度减慢，是