限食对骨骼肌收缩功能和线粒体生物合成的影响

限食对骨骼肌收缩功能和线粒体生物合成的影响

能量代谢的调节功能通常是疾病和衰老的迹象。线粒体作为糖脂代谢和机体供能的重要场所,其主要分布在能量需求高的组织中,如骨骼肌、肝脏、心脏、棕色脂肪等。骨骼肌作为维持机体能量代谢平衡的主要器官之一,其收缩功能也依赖于线粒体提供ATP。肌肉质量和收缩能力的渐行性下降是骨骼肌衰老的一个主要特征,骨骼肌内线粒体DNA突变增加、线粒体相关酶活性降低、线粒体含量减少等线粒体功能衰退的表现都是导致骨骼肌衰老的主要原因骨骼肌并非由单一肌纤维组成。在小腿骨骼肌中,比目鱼肌(soleus,SOL)主要为慢收缩纤维,其富含线粒体和氧化代谢酶,以有氧代谢为主要能量来源;趾长伸肌(extensordigitorumlongus,EDL)内富含快收缩纤维,线粒体含量少,主要以糖酵解的方式获取能量。慢收缩纤维的葡萄糖、脂肪酸摄取率和氧化能力均较快收缩纤维高适当的限食(calorierestriction,CR;即在不引起营养不良的情况下,每日仅摄入正常饮食的60%~70%)被证实无论在哺乳动物还是单细胞生物中均可起到延缓衰老,延长寿命的作用材料和方法1syxk粤SPF级雄性SD大鼠40只,体重(200±15)g,购自于广东省实验动物中心,动物合格证号为SYXK(粤):2010-0104。所有动物适应性饲养1周后,随机分为2组,即自由饮食对照(control)组和CR组,每组10只,实验周期为8周。限食组投食量根据(正常组摄食量/正常组体重×限食组体重×60%)计算,每天分2次投放。2土地酶活性成分的检测2.1骨骼肌收缩功能测定实验干预后,腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)麻醉大鼠,迅速分离左侧比目鱼肌和趾长伸肌,置于预冷充氧的K-H缓冲液中;将骨骼肌条穿过电极刺激环的中央,固定于恒温37℃、持续充以95%O2.2骨骼肌ATP含量检测采用荧光素酶法检测ATP含量,并通过各样本的蛋白含量进行最终标化。ATP检测试剂盒和BCA蛋白测定试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。2.3线粒体生物合成测定酚/氯仿法提取比目鱼肌和趾长伸肌的基因组DNA,取总DNA100ng为模板,加入到20μLPCR反应体系中,反应条件为94℃3min;95℃3min,60℃20s,72℃30s,22个循环;72℃7min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶图像分析,以细胞色素C氧化酶I亚基(cytochromeCoxidasesubunitI,COXI)与β-actin的比值反映线粒体生物合成情况。引物序列见表1。2.5Westernblotting检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)和磷酸化AMPK蛋白的表达取50mg比目鱼肌和趾长伸肌样本置于500μL预冷的RIPA裂解液中,冰上电动匀浆20s,于4℃以12000×g离心15min,取上清。采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。取30μg蛋白进行SDS,湿转法将蛋白转至PVDF膜上,分别孵育相应的I抗和II抗,ECL发光液显影后,通过ChemiDox3数据统计与分析所有数据均以均数±标准差(mean±SD)表示,利用SPSS11.5和Prism5.0统计软件分析。所有数据进行正态性检验。两组样本均数比较采用两个独立样本的t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1大鼠尾二醇对比目鱼肌收缩和疲劳刺激的影响无论是比目鱼肌还是趾长伸肌,限食8周均可导致肌肉重量明显减少,其中以趾长伸肌重量下降更显著(P<0.01)。与对照组相比,限食组比目鱼肌和趾长伸肌给予单次刺激和强直刺激后,其收缩能力明显高于正常对照组(P<0.05)。疲劳刺激120s后,比目鱼肌的收缩力仍然维持在35%以上,说明其抗疲劳能力明显强于正常对照组(P<0.05);而趾长伸肌疲劳刺激120s后收缩水平将至10%以下,与正常对照组无明显差别,见图1。2正常对照组升降限食8周后大鼠比目鱼肌和趾长伸肌内ATP含量均较正常对照组升高约2倍(P<0.01或P<0.05)。无论是正常对照组还是限食组,比目鱼肌ATP的含量均显著低于趾长伸肌,见图2。3基因coxi和核基因-actin传播的比值和比对COXI是调控线粒体氧化磷酸化水平的主要线粒体呼吸链酶之一,仅在线粒体中有表达,故线粒体基因COXI和核基因β-actin拷贝数的比值可一定程度反映线粒体的含量。限食干预后,比目鱼肌内COXI/β-actin比值明显增加(P<0.01),而趾长伸肌内COXI/β-actin比值无改变,见图3。4gc-1及其下游nrfmna的表达限食8周可显著诱导比目鱼肌中调控线粒体功能的PGC-1α及其下游NRFmRNA的表达(P<0.05);但对趾长伸肌内PGC-1α和NRFmRNA的表达无明显诱导作用,见图4。5目鱼肌内p-actk/actk比值的比较限食8周后,比目鱼肌和趾长伸肌中p-AMPK/AMPK比值均较正常对照组明显升高(P<0.01或P<0.05),其中以比目鱼肌内p-AMPK/AMPK比值升高的幅度更显著,见图5。7限制8周对骨骼实质和脑损伤中sod活性和mda含量的影响抗氧化酶系统pge及rt-pcr检测比目鱼肌富含氧化型纤维,趾长伸肌富含糖酵解型纤维,因富含的肌纤维类型不同,导致两种类型的肌肉收缩能力及抗疲劳能力存在差异限食可通过增加线粒体生物合成,增加线粒体DNA含量、线粒体生物合成调节基因如PGC-1a、NRF-1、Tfam的表达以及细胞色素C氧化酶的活性,从而缓解因衰老所致的线粒体功能衰退AMPK作为能量的感受器,在维持细胞内能量平衡中起着主要作用。在限食等能量匮乏时,AMP/ATP比值增加,AMPK被激活,导致分解代谢增加而合成代谢被抑制,葡萄糖转运、脂肪酸氧化以及线粒体呼吸相关基因的表达上调,脂肪合成相关基因的表达下调,ATP合成增多线粒体不仅是产生能量的主要场所,也是细胞内氧自由基的主要来源。当线粒体功能障碍时,氧化应激增加,表现为细胞对氧自由基的清除能力降低,细胞内氧自由基生成增加,导致线粒体呼吸链复合物酶活性被抑制,诱导线粒体DNA发生突变,从而使线粒体出现损伤本实验结果表明,限食可增加骨骼肌的收缩能力,改善线粒体功能,但在不同类型骨骼肌中作用有所差异。其中,限食干预可显著增加比目鱼肌的单次、强直收缩和抗疲劳能力,这可能与AMPK活化,上调PGC-1α转录活性,增加线粒体生物合成有关;而趾长伸肌经限食干预后虽因可改善其单次、强直收缩能力,但抵抗肌肉疲劳的作用效果不明显,可能与其线粒体氧化代谢和生物合成能力受限有一定的关系。2.4RT-PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγcoactivator1α,PGC-1α)和核呼吸因子(nuclearrespiratoryfactor,NRF)mRNA表达Trizol法提取比目鱼肌和趾长伸肌的RNA,取总RNA500ng为模板,用MMLVcDNA合成试剂盒进行逆转录反应合成cDNA。取50ngcDNA加入到20μLPCR反应体系中,反应条件为94℃3min;95℃3min,58℃20s,72℃30s,28个循环;72℃7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶图像分析。引物序列见表1。2.6骨骼肌一氧化氮合酶(NOsynthetase,NOS)活性、NO含量、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定采用比色法检测NOS活性,采用硝酸还原酶法检测NO含量,试剂盒购于南京建成生物有限公司。采用WST催化-抑制法检测总SOD活性,采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量,试剂盒购于广州碧云天生物技术有限公司。各样本中的蛋白含