克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定

克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定

然而，随着人工养殖亩基生虾的迅速扩大，疾病的发生变得越来越频繁和严重。国内已相继报道了克氏原螯虾的螺原体病11.1体重35.0g克氏原螯虾患病虾取自湖北省荆州市某养殖场,体长12.0～14.0cm,体重31.0～35.0g。健康克氏原螯虾购自武汉市东西湖某养殖场,体长12.8～14.0cm,体重30.2～40.0g,于50L容量的水族箱盛少量水,暂养5d后,挑选无损伤、活力好的克氏原螯虾供试验用。1.2克氏原螯虾的分离培养取濒死的具典型暴发病症状的克氏原螯虾病虾,用无菌操作方法进行病原菌分离。即用70%酒精棉消毒克氏原螯虾体表,打开头胸甲和腹部甲壳,从肝胰腺中取样,划线接种于BHI(Difco)琼脂平板培养基上,30℃恒温箱内培养24h后,挑取占优势的单菌落重复划线分离,直至得到纯培养。将纯化的菌株转移到BHI琼脂斜面,冷藏保存备用。1.31菌悬液的制备将纯化后的分离菌株接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上扩大培养,30℃培养18～24h后,用0.85%无菌生理盐水洗下菌苔,制成菌悬液,用平板计数结合光电比浊计数法(波长560nm)测定菌液中细菌浓度,并用无菌生理盐水将菌液最终浓度调至5.0×102不同浓度、剂量的菌悬液对人工感染的影响将经过暂养未显示任何不正常状况的克氏原螯虾平均分组,每组30尾,将每组供试虾放在同一个水族箱中。采用肌肉注射法进行人工感染,在第2和第3腹节之间,对每尾虾分别注射不同浓度、剂量的菌悬液,作为人工感染试验组,另设注射同等剂量的无菌生理盐水的对照组。注射后的克氏原螯虾分别放回水族箱中继续饲养,连续观察7d。从人工感染后出现与自然条件下发病相同症状的濒死克氏原螯虾的肝胰腺中分离、纯化细菌,做再次感染健康克氏原螯虾试验。人工攻毒后每隔1～2h观察1次、记录克氏原螯虾的活动情况,及时收集发病或者死亡的克氏原螯虾。试验用水为经曝气的自来水,试验期间气温变化为21～28℃,控制水温为24～25℃。1.4生化特性试验方法致病菌的生理生化特性试验按照《一般细菌常用鉴定方法》1.5抑菌圈直径测定将培养18～24h的细菌制成菌悬液,均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板上,贴上药敏试纸,于30℃恒温培养24h后,测量、记录抑菌圈直径。每种药物试纸做一个平行样。依照敏感程度将药敏结果分为耐药、中度敏感和敏感。1.61供试药物氨苄青霉素(钠盐)[ampicialin(NaSalt),Roche,批号:080915],硫酸链霉素(streptomycinSulfate,Gibco,批号:080814),盐酸土霉素(oxytetracyclineHCl,Rochi,批号:080926),盐酸四环素(tetracyclineHCl,Rochi,批号:080924),金霉素(aureomycinum,Sigma,批号:080923),硫酸新霉素(neomycinSulfate,Sigma,批号:080913),硫酸庆大霉素(gentamycinSulfate,Rochi,批号:080810),硫酸卡那霉素(kanamycinSulfate,Sigma,批号:080923)交沙霉素(josamycin,Gibco,批号:080805),麦迪霉素(midecamycin,BM,批号:080815),环丙沙星(ciprofloxacin,广州白云山制药总厂,批号:080907),螺旋霉素(spiramycin,广州白云山制药总厂,批号:080916),红霉素(erythromycin,Sigma,批号:080915),烟酸诺氟沙星(norfloxacin,华北制药总厂,批号:080916),先锋霉素Ⅳ(cephalexin,浙江得思德制药有限公司,批号:080907),恩诺沙星(enrofloxacin,华北制药厂,含量大于98%,批号:071124)等16种抗、杀菌药物用于对分离菌株的药物敏感性试验。2最小细菌浓度mic的测量依日本化学疗法学会制定的标准法进行22.1ksax-3菌株的形态观察从患病克氏原螯虾的肝胰腺中分离到KSAX-1、KSAX-2和KSAX-3等3个菌株。将致病力强的KSAX-3菌株纯培养后,观察菌体形态为短杆状,无芽孢,无荚膜。菌落在牛肉膏蛋白胨平板上呈光滑、圆形、隆起、半透明、潮湿的状态。在TCBS琼脂上生长良好,呈绿色,菌落边缘不规则,经过36h的培养,菌落直径在1.5～2.5mm之间。2.2ksax-1和ksax-2菌株的致病性力利用3个分离菌株进行的人工感染试验结果见表1。可以看出,3个分离菌株中,KSAX-1和KSAX-2菌株的致病力比较弱,接种0.1mL不同浓度的菌液后,供试克氏原螯虾的死亡率变化在20.0%～23.3%之间。而KSAX-3菌株的致病力则比较强,当对供试虾注射0.1mL菌液浓度为102.3致病力较强的致病力有对具有较强致病力的2.4生素类药物分离菌株的筛选16种抗生素类药物对3个分离菌株的33.1水产动物致病菌的危害是一种嗜盐性菌,作为水产动物的致病菌,迄今为止只见有对海水养殖鱼类和对虾产生危害的报道3.2克氏原螯虾对微生物的危害V.parahaemolyticus对水产养殖动物是一种条件致病菌,现有的报道证实主要危害海水鱼、虾,例如能引起大黄鱼(现有的研究结果表明,能引起克氏原螯虾发生暴发性死亡的因素很多,除环境因素外,还有生物性因素包括致病性细菌、病毒、真菌和寄生虫等3.3细菌致病性的测定,一般在百分不同抗生素类药物对3个分离菌株的抑菌效果测定结果表明,菌株对氨苄青霉素、新霉素、麦迪霉素、红霉素和先锋霉素Ⅳ等5种抗生素具有比较强的耐受性,这可能与细菌的种类和致病菌所接触抗生素类药物的频率有关。目前在水产养殖生产中,对细菌性疾病的控制主要依靠各种抗菌药物。但是,如果不能科学地使用抗生素类药物,就有可能导致很多副作用的出现。正确的方法应该是在测定致病菌对各种药物敏感性的基础上,合理地选择使用药物。本研究证明了盐酸土霉素、盐酸四环素、环丙沙星、诺氟沙星、金