基因工程步骤专业知识专家讲座

一、学习目标

简述基因工程原理及基本操作过程二、学习重点和难点1、基因工程基本操作程序四个步骤（重点）2、从基因文库中获取目标基因（难点）3、利用PCR技术扩增目标基因（难点）

1.2基因工程基本操作程序基因工程步骤专业知识专家讲座第1页真核细胞基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息表示(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)开启子终止子基因工程步骤专业知识专家讲座第2页非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345转录mRNA前体成熟mRNA加工切除内含子转录部分基因工程步骤专业知识专家讲座第3页原核细胞基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游

编码区下游与RNA聚合酶结合位点开启子终止子能转录对应信使RNA，能编码蛋白质基因工程步骤专业知识专家讲座第4页基因工程基本操作程序目标基因获取基因表示载体构建将目标基因导入受体细胞目标基因检测与判定基因工程步骤专业知识专家讲座第5页一、目标基因获取用3分钟阅读P8-11，并思索以下问题，然后用2分钟与同桌交流、讨论。1、获取目标基因惯用方法有哪些?2、何谓基因文库？其类型有哪几个？3、怎样构建基因文库？4、何谓PCR技术？其原理、条件和过程是怎样？基因工程步骤专业知识专家讲座第6页一、目标基因获取1、目标基因：主要指是编码蛋白质结构基因，也能够是一些含有调控作用因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目标基因；（2）利用PCR技术扩增目标基因；（3）经过DNA合成仪用化学方法直接合成基因工程步骤专业知识专家讲座第7页3、基因文库

又称DNA文库，将含有某种生物不一样基因许多DNA片段，导入受体菌群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不一样基因，全部受体菌集合即为该生物基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。按外源DNA片段起源分基因文库分为：基因组DNA文库：包含了某物种全部基因部分基因文库：只包含了部分基因文库（如cDNA文库）基因工程步骤专业知识专家讲座第8页基因工程步骤专业知识专家讲座第9页1）载体DNA片段制备

DNA分离纯化→限制酶切2）供体DNA片段制备总DNA分离纯化→酶切法→分离特定大小DNA片段3）载体与基因组DNA片段连接4）重组DNA转化受体细胞4.基因文库构建基因工程步骤专业知识专家讲座第10页①基因组文库构建经过对受体菌培养而储存基因基因工程步骤专业知识专家讲座第11页②cDNA文库构建

（反转录法）

目标基因mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目标基因)接到载体基因工程步骤专业知识专家讲座第12页③基因组文库和部分基因文库比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中开启子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物部分基因某种生物全部基因能够部分基因能够基因工程步骤专业知识专家讲座第13页思索：怎样从基因文库中得到我们所需目标基因？

依据基因相关信息如依据基因转录产物mRNA、基因核苷酸序列、基因翻译产物蛋白质等来获取目标基因。基因工程步骤专业知识专家讲座第14页2、利用PCR技术扩增目标基因—聚合酶链式反应PCR基因工程步骤专业知识专家讲座第15页①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物_______复制______________核酸合成技术③条件：________________________________________________、___________、___________________②原理：________________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制已知基因核苷酸序列(前提条件)四种脱氧核苷酸成对引物DNA聚合酶(Taq酶）指数2n使目标基因片段在短时间内成百万倍地扩增基因工程步骤专业知识专家讲座第16页⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成_________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶作用下，合成与模板互补________。氢键单链DNA双链DNA链基因工程步骤专业知识专家讲座第17页PCR基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C退火55-60˚CPCR总结：基因工程步骤专业知识专家讲座第18页3、化学方法人工合成目标基因基因比较小,已知核苷酸序列，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。蛋白质氨基酸序列mRNA核苷酸序列基因核苷酸序列目标基因推测推测化学合成基因工程步骤专业知识专家讲座第19页从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取目标基因方法基因工程步骤专业知识专家讲座第20页二、基因表示载体构建——关键基因工程步骤专业知识专家讲座第21页质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口取得目标基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一个限制酶

目标基因与运载体结合过程，实际上是不一样起源基因重组过程。1、基因表示载体构建方法基因工程步骤专业知识专家讲座第22页2.基因表示载体目标（1）使目标基因在受体细胞中稳定存在并能够遗传给下一代（2）使目标基因能够表示和发挥作用。基因工程步骤专业知识专家讲座第23页3、基因表示载体组成：a、目标基因b、开启子c、终止子d、标识基因等思索：它们有什么作用？基因工程步骤专业知识专家讲座第24页表示载体为何一定要有开启子？（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物本身基因开启子才能有利于基因表示。（2）经过cDNA文库取得目标基因没有开启子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。基因工程步骤专业知识专家讲座第25页终止子作用是什么？

终止子是位于基因尾端一段特殊DNA片断，能终止mRNA转录。

是为了判别受体细胞中是否含有目标基因，从而将有目标基因细胞筛选出来。标识基因有什么作用？基因工程步骤专业知识专家讲座第26页1、原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞路径三、将目标基因导入受体细胞2、方法将目标基因导入植物细胞将目标基因导入动物细胞将目标基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞基因工程步骤专业知识专家讲座第27页（1）农杆菌转化法①特点：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上T-DNA能够转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。基因工程步骤专业知识专家讲座第28页③转化过程:Ti质粒目标基因构建表示载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表示新性状转入农杆菌基因工程步骤专业知识专家讲座第29页

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生动力，将包裹在金属颗粒表面表示载体DNA打入受体细胞中，使目标基因与其整合并表示方法。（2）基因枪法单子叶植物适用此方法基因工程步骤专业知识专家讲座第30页（3）花粉通道法

植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目标基因），使目标基因借助花粉管通道进入受体细胞。适合用于被子植物基因工程步骤专业知识专家讲座第31页胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊基因工程步骤专业知识专家讲座第32页2、将目标基因导入动物细胞②程序：目标基因表示载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物①方法：显微注射法基因工程步骤专业知识专家讲座第33页微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、

遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表示载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目标基因导入微生物细胞基因工程步骤专业知识专家讲座第34页四、目标基因检测与判定分子水平检测:是否插入目标基因是否转录是否翻译个体生物学水平判定基因工程步骤专业知识专家讲座第35页1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目标基因①首先取