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文档简介
绿色银光蛋白绿色银光蛋白第1页Osamu
Shimomura
Martin
Chalfie
Roger
Y.
Tsien
(钱永健)
年10月8日,美Woods
Hole海洋生物学试验室下村修、哥伦比亚大学马丁-沙尔菲和加州大学圣地亚哥分校钱永健三位美国科学家,因为在水母中发觉和研究绿色荧光蛋白而取得年诺贝尔化学奖。绿色银光蛋白第2页
GFP发觉之旅;
1962年,下村修首次从维多利亚多管水母Aequorea
victoria中分离出GFP。他发觉该蛋白在紫外线下会发出明亮绿光。
1992年,道格拉斯·普瑞舍克隆并测定了水母中绿色荧光蛋白基因。
1993年,Martin
Chalfie证实了GFP作为各种生物学现象发光遗传标识价值。在最初一项试验中,他用GFP使秀丽隐杆线虫6个单独细胞有了颜色。
1994年,钱永健开始改造荧光蛋白,培育出黄色、蓝色、绿色、红色等各种颜色荧光蛋白,了解了GFP发出荧光机制。世界上当前使用荧光蛋白大多是钱永健试验室改造后变种。令在同一时间跟踪多个不一样生物学过程成为现实。钱永健还开发了检测荧光蛋白荧光探针技术。绿色银光蛋白第3页维多利亚多管水母(Aequorea
victoria)绿色银光蛋白第4页GFP介绍
维多利亚多管水母生活在北太平洋严寒水域。这种水母体内含有一个生物发光蛋白质——aequorin,它本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿色,也就是当水母容光焕发时候咱们实际看到颜色。GFP纯溶液在经典室光下呈黄色,不过当被拿到户外阳光下时,它会发出鲜绿颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光,然后以能量较低绿光形式发射出来。绿色银光蛋白第5页GFP结构蛋白序列SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIGFP由238个氨基酸残基组成,分子量约为26.9kDa。绿色银光蛋白第6页GFP结构GFP结构绿色银光蛋白第7页GFP结构绿色银光蛋白第8页GFP结构GFP结构绿色银光蛋白第9页GFP晶体结构显示,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420nm,宽240nm,由11个β片层组成桶状组成疏水中心和由4个α螺旋以及其中一个α螺旋包含着发光基团组成。
GFP结构绿色银光蛋白第10页GFP结构桶顶部由3个短垂直片段覆盖,底部由一个短垂直片段覆盖,对荧光活性很主要生色团则位于大空腔内。严密桶形结构保护着荧光基团,预防它被周围环境淬灭。试验表明GFP荧光产生前提是桶状结构完整性,去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸,GFP均会失去荧光。这是因为生色团形成效率较低,而且形成过程受外界环境影响较大缘故绿色银光蛋白第11页GFP结构GFP结构绿色银光蛋白第12页GFP独特结构由238个氨基酸组成“像一个罐头”每个单体由11个反向平行
-sheets围绕,4个
-helix组成,其中一个
-helix位于“罐头”内大约长420nm,宽240nm荧光基团位于关键
-helix绿色银光蛋白第13页GFP结构绿色银光蛋白第14页由α螺旋含有发光基团由第65、66、67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团组成。翻译出蛋白质折叠环化之后,在O2存在下,分子内第67位甘氨酸酰胺对第65位丝氨酸羧基亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基,第66位酪氨酸α2β键脱氢反应之后,造成芳香团与咪唑基结合。这么,GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团,该过程能够自动催化完成。绿色银光蛋白第15页绿色银光蛋白第16页1.两个野生型GFP吸收紫外光和蓝光,发射绿光,在395nm出现一个最大吸收峰,在470nm出现一个小吸收。出现两个吸收峰原因可能是因为存在阴性和中性两个不一样化学结构生色团。因为存在两个吸收峰,野生型GFP能够被标准长波紫外源和异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)所激发。GFP性质绿色银光蛋白第17页2.能够在单独或者与其它蛋白融合时产生荧光。而其最显著特点是除了氧气之外,不需要其它辅酶,不需底物。3.Baird等研究人员发觉,即使GFP有紧密桶状结构和形成发光基团所必需复杂翻译后修饰,当对GFPN端和C端个别交换重排并以一段间隔重新连接时,GFP依然含有荧光。而且,GFP一些位点能够耐受整段蛋白插入,在结合金属离子黄色荧光蛋白(YellowFluorescentProtein,YFP,GFP突变体)中145位插入锌指结构能使荧光强度多倍提升。绿色银光蛋白第18页4.GFP作为汇报分子含有很多优点,如实现了活细胞内基因表示和定位、荧光为蛋白内在属性、荧光发射无种属依赖性、荧光信号对光漂白含有高抗性、检测时不需要附加辅助因子、在细菌和真核细胞中表示无显著毒性、含有高度稳定性。另外,细胞内GFP检测也比较简单,如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞分选仪等,现有报道利用实时定量PCR进行GFP荧光定量测定方法。绿色银光蛋白第19页GFP应用1.在蛋白质相互作用和构型改变研究中应用一个活细胞内蛋白质相互作用研究方法是蛋白质片断互补测定法(protein-fragmentcomplementationassay,PCA)。将标识蛋白在某个位点打开,用片断分别标识两个蛋白。假如被标识蛋白质相互作用,则酶或荧光蛋白片断靠近并重新折叠恢复活性。
Hu等提出了双分子荧光互补试验(BiFC)概念,用互补荧光片断标识不一样蛋白来研究bZIP和Rel转录因子家族相互作用,确定了相互作用位置,信号传递对作用位点调整等。
绿色银光蛋白第20页
荧光互补不但仅在蛋白质相互作用中有所应用,Jeong等研究人员以与底物结合时会有经典构象改变麦芽糖结合蛋白(MBP)为模型,将MBPC端和N端分别与GFP片断融合。结果证实加入底物一组显示出比对照组更强荧光,由此提出split-GFP在观察蛋白构型改变中应用。另外,一个主要荧光成像技术—荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)也被广泛应用。它能够利用GFP及其突变体青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)等,定时、定量、定位、无损伤地在活细胞内检测大分子构象改变、蛋白之间相互作用、信号传递路径。绿色银光蛋白第21页2.GFP在信号转导中应用研究发觉,一些突变GFP能够发生荧光共振能量转移(FRET),FRET对于两个荧光分子相互间定位和距离高度敏感(在纳米范围内)。两个分子间微小线性或空间定位关系破坏能够强烈地改变能量转移效率。经过计算供给分子对于接收分子荧光释放比率来观察细胞动态改变指标。它消除了GFP分子在绝对浓度、细胞厚度、激发源能量度以及检测绝对效率等影响。利用FRET能够作成GFP依赖生物探针,现已经有研究人员设计大分子或分子配对物来改变GFP之间原有生理信号反应FRET。绿色银光蛋白第22页
在上述试验基础上,研究人员设计了FRET依赖Ca2+敏感指示剂,该试验发觉,经过改变两个GFP之间距离,可增加FRET。另有一些研究人员,并没有把两个GFP融合在一个单一结构中,而是把一个GFP融合到CaM上,另一个GFP融合到CaM结合区域。结果发觉,当Ca2+结合到CaM上,出现分子间异源二聚体,两个GFP足够靠近而产生FRET。这个试验提醒了FRET不但能够在分子内发生,而且还可在分子间发生。绿色银光蛋白第23页
最近,有学者用GFP依赖生物传感器测量活细胞内生化动力学,经过利用带有GFP标识蛋白激酶A转染细胞,观察相关cAMP动态荧光改变。经过融合蓝色荧光GFP到调整亚单位或融合绿色荧光GFP到PKA催化亚单位,设计出了cAMP传感器。当cAMP浓度很低时,两个荧光分子距离很近,并出现FRET,假如增加cAMP浓度,发生FRET可能性急剧下降。利用该方法,能够检测出cAMP动态改变,并开创了在整体条件下,研究cAMP调整信号转导路径新方法。绿色银光蛋白第24页GFP结构即使含有高度完整性,不过试验中发觉,在GFP中一些确定位置,插入外源基因,完全没有丧失其荧光性。当把CaM插入黄色荧光GFP突变体中,得到Ca2+
传感器,当Ca2+
结合到CaM上,造成生色团去质子化,使荧光强度增加7倍。当在黄色荧光GFP中插入一个Zif268锌指结构,能够得到传导Zn2+
GFP,结果发觉荧光少许增加,为改变前1.7倍,Kd值约0.4mmol。插入外源基因致使GFP荧光敏感性增强现象,提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导新路径。绿色银光蛋白第25页改进GFP应用前景
蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白,绿色荧光蛋白,黄色荧光蛋白,褐色。。。。。。1.提升了GFP光谱性质,2.提升荧光强度3.提升光稳定性4.颜色突变5.pH敏感突变体
绿色银光蛋白第26页
到当前为止,改进荧光蛋白已经有非常广泛应用,如转染细胞确实定,体内基因表示测定,蛋白质分子定位和细胞间分子交流动态监测,免疫分析、核酸碱基探针分析,以及分子间第二信使钙离子和cAMP水平指示,细胞间隙pH改变检测。另外,GFP也能够和其它蛋白质形成融合蛋白,作为基因治疗检测指标。但GFP在应用中还发觉有许多问题亟待处理:(1)荧光信号强度非线性性质使得定量非常困难。
(2)多数生物含有微弱自发荧光现象,并有着类似激发和发射波长,这个荧光背景会影响一些GFP检测。
(3)试验中发觉极难建成GFP稳定细胞株,可能与GFP参加细胞凋亡过程相关。绿色银光蛋白第27页详细研究领域1、骨架和细胞分裂2、细胞器动力学和泡囊运输3、发育生物学4、神经生物学5、其它应用6、GFP载体和技术7、其它有用GFP链接
绿色银光蛋白第28页应用GFP研究结果美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光”猫
绿色银光蛋白第29页杰夫·利希曼利用荧光蛋白展现了大脑内连接,图片中漂亮“彩虹”就是神经系统网络
1997年在大阪大学降生第一
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