基因导入受体细胞

基因导入受体细胞基因导入受体细胞第1页4.1受体细胞

受体细胞(receptorcell)又称为宿主细胞或寄主细胞(hostcell)等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持细胞；从试验目标上讲是有应用价值和理论研究价值细胞。基因导入受体细胞第2页作为基因工程宿主细胞必须具备以下特征：便于重组DNA分子导入；能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；便于重组体筛选；遗传性稳定高，易于扩充培养或发酵生长；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表示产物在细胞内积累，或促进外源基因高效分泌表示。在遗传密码应用上无显著偏好性；含有很好翻译后加工机制，便于真核目标基因高效表示；在理论研究和生产实践上有较高应用价值。基因导入受体细胞第3页基因工程中常见受体细胞类型：原核生物细胞真核生物细胞真菌细胞植物细胞昆虫细胞动物细胞基因导入受体细胞第4页原核生物细胞优点：大个别原核生物细胞无纤维素组成坚硬细胞壁，便于外源DNA进入。没有核膜，染色体DNA没有固定结合蛋白质，为外源DNA与裸露染色体DNA重组降低了麻烦。原核生物多为单细胞生物，轻易取得一致性试验材料，而且培养简单，繁殖快速，试验周期短，重复试验快。基因组小，遗传背景简单，而且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入外源基因进行遗传分析。基因导入受体细胞第5页缺点：原核生物细胞不具备真核生物蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表示，得到多是无特异性空间结构多肽链。原核生物细胞缺乏真核生物蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质生物活性正是依赖于其侧链糖基化或磷酸化等修饰作用。原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表示产物不稳定。基因导入受体细胞第6页至今被用作受体菌原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。一、大肠杆菌受体细胞大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是当前为止研究得最为详尽、应用最为广泛原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟载体受体系统。优点：繁殖快速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量内毒素，可造成人体热原反应。基因导入受体细胞第7页二、枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：枯草杆菌含有胞外酶分泌－调整基因，能将含有表示产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表示产物提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便含有天然构象和生物活性。枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一个安全基因工程菌。枯草杆菌含有芽孢形成能力，易于保留和培养。枯草杆菌也含有大肠杆菌生长快速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。应用：已成功用于表示人β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒关键抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。基因导入受体细胞第8页三、蓝细菌（蓝藻）蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，含有光合系统Ⅰ(PSⅠ)

和光合系统Ⅱ(PSⅡ)、能进行光合作用，但它又含有细菌特征，无细胞核及双层膜结构细胞器，染色体裸露，是一个经典原核生物。蓝藻作为表示外源基因受体菌兼具微生物和植物优点，详细表现在：基因组为原核型，除了裸露染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA检测。细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜温度就能满足生长需要。各种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好条件。蓝藻富含蛋白质，而且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采取转基因技术，把一些主要药品基因转入无毒蓝藻，就可到达锦上添花效果。基因导入受体细胞第9页真核生物细胞一、真菌受体细胞真菌是低等真核生物，其基因结构、表示调控机制以及蛋白质加工与分泌都含有真核生物特征，所以利用真菌细胞表示高等动植物基因含有原核生物细胞无法比拟优点。酵母菌细胞是单细胞真核微生物，外源真核基因最理想表示系统。优点：酵母菌是结构最为简单真核生物之一，其基因表示调控机理比较清楚，遗传操作相对比较简单。含有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。不含有特异性病毒，不产生毒素。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。能使外源基因表示产物分泌至培养基中，便于产物提取和加工。基因导入受体细胞第10页二、植物受体细胞优点：全能性，即一个分离活细胞在适当培养条件下，较轻易再分化成植株，这意味着一个取得外源基因体细胞能够培养出能稳定遗传植株或品系。缺点：植物细胞有纤维素参加组成坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。现在用作转基因受体植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。基因导入受体细胞第11页三、动物受体细胞：优点：能识别和除去外源真核基因中内含子，剪切和加工成熟mRNA。真核基因表示蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物含有很好蛋白质免疫原性，约为酵母细胞16～20倍。易被重组DNA质粒转染，含有遗传稳定性和可重复性。经转化动物细胞可将表示产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。缺点：组织培养技术要求高，难度较大。当前用作基因转移受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等试验动物，主要用途在于大规模表示生产天然状态复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种遗传改良及人类疾病基因治疗等。常见动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞优点。

基因导入受体细胞第12页4.2.1重组质粒DNA分子转化大肠杆菌

转化：重组质粒DNA分子经过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表示过程称之为转化。转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球菌中发觉。4.2重组DNA分子转入原核生物细胞基因导入受体细胞第13页目录基因导入受体细胞第14页细菌转化本质是受体菌直接吸收来自供体菌游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中经过遗传交换将之组合到本身基因组中，从而取得供体菌对应遗传性状过程。基因导入受体细胞第15页以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化一个可能机制包含以下基础步骤：①细菌感受态形成。当转化因子靠近细菌细胞时．受体细胞分泌一个小分子质量激活蛋白，又称为感受因子，能诱导使细菌胞壁个别溶解，局部暴露出细胞膜上DNA结合蛋白和核酸酶等，此时细菌细胞处于感受态，极易接纳周围环境中转化因子以实现转化。基因导入受体细胞第16页②转化因子吸收。受体菌细胞膜上DNA结合蛋白可与转化因子双链DNA结构持异性结合，然后激活邻近核酸酶，将双链DNA分子中一条链逐步降解，同时将另一条链逐步转移到受体菌内。基因导入受体细胞第17页③整合复合物前体形成。进入受体细胞单链DNA与另一个游离蛋白因子结合，形成整合复合物前体，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。基因导入受体细胞第18页

④单链DNA转化因子整合。整合复合物前体中单链DNA片段能够经过同源重组，置换受体细胞染色体DNA同源区域．形成异源杂合双链DNA结构。

基因导入受体细胞第19页⑤转化子形成。受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染色体发生分离，形成一个新转化子。基因导入受体细胞第20页大肠杆菌是一个革兰氏阴性菌，自然条件下极难进行转化，其主要原因是转化因子吸收较为困难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞正是依据大家需要构建外源重组质粒DNA分子，而非来自供体菌游离DNA片段(转化因子)。所以在大肠杆菌转化试验中，极少采取自然转化方法，通常做法是首先采取人工方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性方法之一是Ca2+诱导大肠杆菌转化法。基因导入受体细胞第21页（1）Ca2+诱导大肠杆菌转化法Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化可能原因：①在0℃Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中个别核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。②Ca2+能与加入DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。基因导入受体细胞第22页基因导入受体细胞第23页该法重复性好。操作简便快捷，适合用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA能够取得5×106～2×l07个转化茵落，完全能够满足质粒常规克隆需要。基因导入受体细胞第24页Mg2+对DNA分子有很大稳定性作用，所以利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，能够提升DNA转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等深入处理细胞，能诱导高频感受态细胞形成，转化效率可提升100～1000倍，且对大小质粒分子均可进行有效转化。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常极少采取。基因导入受体细胞第25页DNA分子进入大肠杆菌受体细胞机制

普通认为只有双链闭环或开环质粒DNA分子才能转化，而线形DNA分子不能取得转化子。所以，环状DNA分子中混杂线形DNA分子，会影响环状DNA分子转化效率。也有些人认为吸附在受体细胞表面上是双链DNA，但却以单链DNA进入细胞，这与革兰氏阳性菌转化过程相同。基因导入受体细胞第26页转化处理过程中，可能感染杂菌，造成假阳性转化子出现，所以须设以下几个对照处理：DNA对照处理。转化处理液中用0.2ml无菌水代替0.2m1感受态细胞，检验DNA溶液是否染菌。感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE缓冲液代替0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染菌。感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml感受态细胞中加入0.1ml已知轻易转化这种感受态细胞质粒DNA。基因导入受体细胞第27页（2）电穿孔转化法基础原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation)．形成可逆瞬间通道，从而促进外源DNA有效吸收。电穿孔转化法效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数影响，经过优化这些参数，每ugDNA能够得到109－1010转化子。研究表明，当电场强度和脉冲时间组合方式造成50％~70％细菌死亡时，转化水平到达最高。

基因导入受体细胞第28页用于电穿孔转化法细胞处理要比感受态细胞制备轻易得多．当细菌生长到对数中期后给予冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液离子强度，并用10％甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×l010个／m1。分装，在干冰上速冻后置于－70℃贮存。这么，每小份细胞融解后即可用于转化，使用期达6个月以上。电穿孔转化须在低温下(0－4℃)进行，转化效率要比在室温下操作提升约100倍。基因导入受体细胞第29页（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌简称为三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒迁移作用而建立一个DNA转化方式．适合用于那些难以采取Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化受体菌。非接合型质粒分子较小，缺乏编码质粒转移体系所须全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但假如在宿主细胞中存在另外一个溶合性接合型质粒（即辅助质粒），非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存接合型质粒引发非接合型质粒转移过程称为迁移作用。基因导入受体细胞第30页接合型质粒分子较大，自我转移随意性强，转移过程中经常伴伴随宿主细胞染色体高频转移，所以难以作为基因工程载体使用。当前常见质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因接合型质粒基础上构建，故重组质粒DNA分子也不能直接接进行接合转化．而只能经过其迁移作用来完成。基因导入受体细胞第31页首先将含有接合转化功效辅助质粒转移至含有重组质粒供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使二者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程包括到3种相关细菌菌株，即待转化受体菌、含有要转化重组质粒DNA供体菌和含有广泛宿主辅助质粒辅助菌，所以称为三亲本杂交接合转化法。基因导入受体细胞第32页基因导入受体细胞第33页（4）转化率计算及其影响原因

转化率是指DNA分子转化受体菌取得转化子效率，有两种表示方式：一是以转化子数与用于转化处理DNA分子数或质量比率表示；二是以转化子数与用于转化处理受体细胞数比率表示。用每单位质量DNA分子取得转化子数来表示，难以反应分子大小与转化率之间关系。基因导入受体细胞第34页以用于转化处理受体细胞数为基数来计算转化率，首先必须经过菌液OD值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞受体菌总数。然后计算转化子与受体菌比率。基因导入受体细胞第35页影响转化率原因分子质量较小重组质粒DNA分子转化率较高，分子质量较大重组质粒DNA分子转化率较低，对于大于30kb重组质粒则极难进行转化。组成重组DNA分子载体类型及其构型。与受体细胞亲和性较强质粒载体转化率要高于亲和性较弱质粒载体，而处于自然双螺旋闭环结构质粒载体比开环结组成线性结构质粒载体有更高转化率。经体外酶切、酶连操作后载体DNA或重组DNA分子因为空间构象难以恢复，转化率普通要比含有超螺旋结构质粒低两个数量级。重组DNA分子浓度和纯度。在10ng／100u1以下DNA浓度范围内，转化效率与DNA分子数成正比关系。基因导入受体细胞第36页同一重组质粒DNA分子转化不一样受体菌细胞，转化率不一样——受体细胞选择对于重组DNA分子转化也是极为主要。前述三种转化方法中，最正确转化率以电穿孔法最高（108~1010）；Ca2+诱导转化法居中（107~108）；而三亲本杂交转移法最低（104~105），但它适于前两种方法难以转化受体菌。基因导入受体细胞第37页在转化操作方而，受体细胞预处理或感受态细胞制备对转化率影响最大。如Ca2+诱导大肠杆菌转化法，菌龄、Cacl2处理时间、感受态细胞保留期以及热激时间均是主要影响原因。电穿孔转化法中，对受体细胞进行冰冻甘油预处理后转化率，要比不经此预处理转化率高10~100倍。

基因导入受体细胞第38页5.2.2重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌

将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中过程，称为转染。将重组λ噬菌体DNA分子导入大肠杆菌受体细胞常规方法是转导操作。转导(transduction)是指经过λ噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞路径把外源DNA分子转移到受体细胞内过程。基因导入受体细胞第39页含有感染能力λ噬菌体颗粒除含有λ噬菌体DNA分子外，还包含外被蛋白。以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重组A噬菌体DNA分子进行体外包装。体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生一系列特殊包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包装为成熟含有感染能力λ噬菌体颗粒技术。基因导入受体细胞第40页基础原理，依据λ噬菌体DNA体内包装路径，分别取得缺失D包装蛋白λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋白λ噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包装λ噬菌体DNA，但将它们分别感染大肠杆菌，从中提取缺失D蛋白包装物（含E蛋白)和缺失E蛋白包装物(含D蛋白)，二者混合后就能包装λ噬菌体DNA。基因导入受体细胞第41页λ噬菌体DNA体外包装主要过程①制备包装物。首先，须培养两种溶原菌第二，诱导溶菌生长第三，搜集和贮存包装物。②体外包装。制备λ噬菌体DNA混合液。第一次包装。包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出包装物可马上用于包装。第二次包装。进行第二次包装，可提升包装效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包装反应液黏度，便于包装反应进行。去除细胞屑。第二次包装后，在反应液中加入SM溶液和氯仿，混匀后离心去除碎屑。上清液中含活噬菌体颗粒。基因导入受体细胞第42页经过体外包装噬菌体颗粒能够感染适当受体菌细胞，并将重组λ噬菌体DNA分子高效导入细胞中。在良好体外包装反应条件下，每μg野生型λ噬菌体DNA可形成108～109pfu。对于重组λ噬菌体DNA，包装后成斑率要比野生型有所下降，但仍可到达106～107pfu，完全能够满足构建真核基因组基因文库要求。基因导入受体细胞第43页5.2.3受体细胞选择

野生型大肠杆菌不是理想受体细胞，因为本身含有限制和修饰系统，另外还可能存在潜在致病性。所以必须经过适当诱变伎俩对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以取得适宜作为受体细胞突变菌株。通常应从以下几个方面加以考虑：基因导入受体细胞第44页①限制与修饰系统这是造成外源重组DNA转化或转导效率低下主要原因之一。应选取限制系统缺点型突变菌株作为受体细胞，以提升外源DNA分子转化或转导效率。深入使修饰系统也发生缺点，则受体菌细胞既不能修饰，也不能限制外源DNA分子，更便于重组DNA分子各种基因操作。基因导入受体细胞第45页②重组系统

进入野生型细胞外源DNA分子能自发地与染色体DNA发生体内同源重组反应由rec基因家族编码产物所控制。RecA蛋白能促进DNA分子之间同源联会和DNA单链交换，recA基因突变使大肠杆菌细胞内遗传重组频率降低至10-6。recB、recC和recD基因突变也能够降低遗传重组发生频率。所以受体细胞必须选择体内同源重组缺点型遗传表型，基因型为recA-、recB-或recC-等，有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。基因导入受体细胞第46页③易于转化或转导能够利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁通透性及细胞膜特异吸附性，从而提升其转化效率。还能够选择能够诱导形成感受态细胞菌株作为受体菌细胞．基因导入受体细胞第47页④有显著选择性差异遗传表型差异大，可便于重组子检测。通常是使受体细胞展现与载体所携带选择标识互补遗传性状。如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有AMP抗性标识基因，则所选取受体细胞应对这种抗生素敏感。当重组DNA分子转入受体细胞后，载体上标识基因赋予受体细胞抗生素抗性特征，据此能够区分转化子与非转化子。假如受体细胞含有与外源基因表示产物活性互补遗传特征．能够直接筛选到外源基因表示转化细胞。基因导入受体细胞第48页⑤感染寄生缺点型从安全角度上考虑，受体细胞不能含有感染寄生性。基因导入受体细胞第49页5.2.4重组DNA分子转入真核细胞5.2.4.1重组DNA分子导入植物细胞（1）农杆菌介导Ti质粒载体转化法农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。含有趋化性农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其Ti质粒上T-DNA转移至细胞内部。依据这一性质，将待转移目标基因组入Ti质粒载体，经过农杆菌介导进入植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表示。基因导入受体细胞第50页用于植物基因转化操作受体通常称为外植体。选择适宜外植体是成功进行遗传转化首要条件，而外植体选择主要是依据受体细胞转化能力来决定。当前作为基因转化外植体材料非常广泛，包括到植物各个组织、器官和部位。基因导入受体细胞第51页选择适当转化外植体①优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。②要注意外植体年纪，应选择转化能力较强幼期外植体，同时还要考虑其最正确感受态时期。③转化外植体易于组织培养，并有较强再生能力。④应考虑外植体中易被转化分生组织感受态细胞所在部位及其数量。切割外植体时应尽可能地暴露分生组织细胞，增加农杆茵与分生组织接种面积。基因导入受体细胞第52页农杆菌接种操作

外植体农杆菌接种就是把农杆菌接种到外植体损伤切面。通常采取较低菌液OD值和较短浸泡时间来进行外植体接种。将接种农杆菌后外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上，伴随外植体细胞分裂和生长，农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长，故该培养过程称之为农杆菌与外植体共培养。因为农杆菌附着侵染、T-DNA转移及整合都是在共培养时期内完成，所以共培养技术条件掌握是整个转化关键步骤。其中共培养时间对转化率有着很大影响，基因导入受体细胞第53页与农杆菌共培养后外植体表面及浅层组织中经常共生有大量农杆菌，对外植体正常生长会产生不利影响，必须进行脱菌培养以杀死和抑制农杆菌生长。脱菌培养是指把共培养后外植体转移到含有抗生素培养基上继续培养生长过程。当前使用最多是头孢霉素。最终，还须将外植体转移至筛选培养基上继续培养，筛选出被转化细胞，经再分化培养成再生植株。基因导入受体细胞第54页针对不一样外植体以及不一样转化目标而建立各种转化方法，主要包含叶盘转化法、植株接种共转化法、植物愈伤组织共培养转化法、植物悬浮细胞共培养转化法和原生质体共培养转化法等。基因导入受体细胞第55页②整体植株接种转化法：人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植株体内、使农杆菌按照天然感染过程在植株体内进行侵染，取得转化植物愈伤组织或转基因植株。基因导入受体细胞第56页③原生质体共培养转化法即取含重组Ti质粒农杆菌同刚才再生出新细胞壁原生质体作短暂共培养，促使农杆菌与植物细胞之间发生遗传物质转化。用此方法已成功地实现了植物细胞体外转化。④悬浮细胞共培养转化法。此方法类似于原生质体共培养转化法，主要差异是首先建立悬浮细胞系。基因导入受体细胞第57页(2)DNA直接转移DNA直接转移是指利用植物细胞生物学特件、经过物理化学方法将外源基因转入受体植物细胞技术。为克服农杆菌介导法宿主不足，巳发展了电击法(电穿孔法)、基因枪法(微弹轰击法)、激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法，多聚物介导法、花粉管通导法等DNA直接转移技术。基因导入受体细胞第58页①多聚物介导法聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等是常见帮助基因转移多聚物，尤以PEG应用最广。这些多聚物和二价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)与DNA混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒，经过原生质体内否噬作用而被吸收进入细胞内。基因导入受体细胞第59页聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等都是细胞融合剂。它们能够使细胞膜之间或使DNA与膜形成份子桥，促使相互间接触和粘连。还能够引发膜表面电荷紊乱，干扰细胞间识别，从而有利于细胞膜间融合和外源DNA进入原生质体。本法中线性DNA比环形DNA有更高转化效率，而单链DNA又比双链DNA更为有效。这与质粒DNA分子对大肠杆菌细胞转化完全相反。基因导入受体细胞第60页②电穿孔转化法细胞膜基础成份是磷脂双分子层，在适当外加电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会造成细胞致命伤害，当移去外加电压后，被击穿膜孔可被修复。基因导入受体细胞第61页③激光微束穿孔转化法此方法是利用直径很小，能量很高激光微束能引发细胞膜可逆性穿孔原理，在荧光显微镜下找出适当细胞，然后用激光光源替换荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围外源DNA分子随之进入细胞。这种利用激光微束照射受体细胞实现外源DNA直接导入、整合和表示技术称之为激光微束穿孔转化法。激光微束穿孔转化法优点：操作简便快捷；基因转移效率高；无宿主限制，可适合用于各种动植物细胞、组织、器官转化操作，而且因为激光微束直径小于细胞器，可对线粒体和叶绿体等细胞器进行基因操作。但该法需要昂贵仪器设备；技术条件要求高；稳定性和安全性等都不如电穿孔法和基因枪法。基因导入受体细胞第62页④显微注射法利用显微注射仪，经过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核基因转化方法。这一技术关键是原生质体或具壁细胞或细胞团固定。因为动物细胞含有独特贴壁生长待性，所以不存在固定细胞问题，这为动物细胞显微注射创造了十分有利条件，也是动物细胞能广泛使用该技术原因之一。不过，对植物细胞而言，首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。基因导入受体细胞第63页⑤超声波介导转化法利用低音强脉冲超声波物理作用，可逆性地击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA进入细胞。利用超声波处理能够防止脉冲高电压对细胞损伤作用，有利于原生质体存话，是一个有潜力转化路径。基因导入受体细胞第64页⑥基因枪法又称微弹轰击法，是利用高速运行金属颗粒轰击细胞时能进入细胞内现象，将包裹在金属颗粒（钨或金颗粒）表面外源DNA分子随之带入细胞进行表示基因转化方法。基因导入受体细胞第65页⑦脂质体介导法脂质体是由人工构建磷脂双分子层组成膜状结构，能够将DNA包在其内，并经过脂质体与原生质体融合或因为原生质体吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。优点是包在脂质体内DNA可免受细胞DNA酶降解。基因导入受体细胞第66页⑧花粉管通道法将外源DNA涂于授粉枝头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织经过珠心进入胚囊，转化还不具正