马立克氏病疫苗在鸡细胞系上培养工艺的优化

马立克氏病疫苗在鸡细胞系上培养工艺的优化

目前，采用marregrime（md）针、f鸡育种和用作疫苗毒培养基质的方法存在，细胞生产过程中成本高、生存时间短，不利于病毒的大量传播，以及生产区的污染风险。本研究旨在比较MD疫苗毒CVI988与FC-126株在CEF和DF-1细胞系上的生长特性,摸索其在DF-1细胞系上的最佳培养工艺以及由此培养方法制备的MD疫苗毒对鸡的保护效力。1材料和方法1.1制备fc-126、cvi988蛋白和疫苗原代鸡胚成纤维细胞(chickenembryofibroblasts,CEF)按常规方法制备。DF-1细胞购于ATCC,登录号为CRL-12203,送达实验室后,扩繁2代并冻存于液氮中。鸡马立克火鸡疱疹病毒FC-126株(简称FC-126)和CVI988病毒以及攻毒用强毒株MD5均由农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室以及广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室保存,对照组用的FC-126冻干苗与CVI988液氮苗为市售商品疫苗。胰酶EDTA消化液、DMEM高糖培养基粉剂、胎牛血清(FBS)以及新生牛血清(NBCS)均为Gibco公司产品。其他常规试剂耗材均购自英韦创津公司。1.2培养基和试剂配制3种不同的DMEM高糖培养基,编号为1~3,1,2号为Gibco公司商品液体培养基(批号11965,11995),3号为Gibco公司12800干粉用注射用水配制,NaH-CO1.3比较df-1细胞的血清培养在1.2试验结果的基础上,取FBS和NBCS进行冻存复苏生长对比试验,以及正常传代对比试验,10%血清,置于37℃、5%CO1.4cvi988和fc-126病毒在df-1细胞上的适应性在1.2以及1.3试验结果的基础上,将CVI988和FC-126病毒分别接种于单层DF-1细胞,10%血清贴壁2h,2%血清维持,置于37℃、5%CO1.5接种剂量对病毒生长的影响病毒液细胞含量约3×101.6这种培养方法对病毒生长的影响一次细胞技术是指在CEF和DF-1细胞上接种CVI988和FC-126病毒后培养至收获即可;二次细胞技术1.7cmi8和h-126病毒9的连续pfi试验将分别在CEF细胞和DF-1细胞上传代的病毒进行连续7代次的PFU测定。1.8cmi88和lc-126溶液氮苗保护率自制疫苗完全参照中华人民共和国兽用生物制品规程2000版2结果2.1df-1细胞培养同期培养试验证明DF-1细胞最适培养基为3号自配培养基。无论是生长速度,还是细胞形态,都比其他培养基要好(图1)。2.2fbs比bcs生长速度更快由图2可知,FBS无论在细胞冻存以及复苏或者细胞培养效果均比NBCS要好,生长速度也较快,特别是冻存的细胞在进行复苏时,使用FBS比NBCS无论在细胞恢复生长速度还是细胞形态都有较大的优势。2.3df-1细胞不同感染时间细胞的变化CVI988和FC-126病毒均可在DF-1细胞上增殖。CEF细胞和DF-1细胞感染病毒后病变过程有差异,CEF细胞在感染细胞达到80%左右时周边细胞就开始脱落,很快就成片整体脱落,而DF-1细胞则是随着细胞感染数量的增加,死亡细胞脱落悬浮于培养液中,但活细胞依然保持贴壁。另外CVI988病毒在CEF细胞上的增殖速度比在DF-1细胞上稍快,而FC-126病毒则基本无差异。2.4df-1细胞后感染df-1细胞结果表明,FC-126病毒以1∶50至1∶100倍稀释后接种DF-1细胞后感染效果最佳,经4~5d即可出现80%病变,CVI988病毒稀释倍数与FC-126病毒类似。2.5不同的接种方法对病毒生长的影响运用二次细胞技术可以使FC-126和CVI988病毒的PFU含量增加,较好的弥补了细胞感染后死亡脱落的影响(表1)。2.6df-1细胞数和df-1细胞n由表2可知CVI988病毒在CEF细胞上每mL病毒的PFU数稍高于DF-1细胞,但其测定时的病变率也比DF-1细胞高。由表3可知FC-126病毒在DF-1细胞上的平均PFU数与CEF细胞差别不大,且随着传代次数增加滴度有增加趋势。2.7疫苗的保护指数在饲养至14周以后终止试验,统计健康和死亡鸡只数发现,以DF-1为基质制备的疫苗的保护指数与普通商品苗相当(表4),其中非特异性死亡鸡只来自于前2周,且并未出现任何MD症状,可能是腹腔接种操作不当造成的损伤所致。3讨论3.1cef细胞培养目前MD疫苗在生产上都是使用SPF鸡胚制作CEF细胞作为疫苗毒培养的基质。该方法主要存在以下几点弊端:(1)CEF细胞制作费时费力;(2)使用SPF鸡胚成本高;(3)CEF细胞生存时间短,不利于病毒大量扩增;(4)细胞制作过程中污染风险高。因此,国外已在尝试使用传代细胞系代替CEF细胞来培养MDV。Abujoub等3.2fc-126、cvi988病毒在cef细胞上的增殖速度3号自配培养基在DF-1细胞培养中取得了良好的效果,细胞传代比例在1∶3至1∶5之间均可取得良好的生长效果。FBS无论在细胞冻存复苏或者细胞培养效果均比NBCS要好,但价格较高。在本研究中,DF-1细胞和CEF细胞感染病毒后病变过程不同,CEF细胞在感染病毒时很快就成片脱落,而DF-1细胞只有病变死亡细胞脱落而活细胞仍然保持贴壁生长,这说明DF-1细胞的贴壁能力比CEF细胞强,感染病毒后存活能力更强,并且存活细胞仍然可以感染正常细胞,因此即使错过最佳收毒时间,也有一定的使用价值,而不像CEF细胞因脱落而导致报废,这对大规模生产来说比使用CEF细胞是一种利好。CVI988病毒在CEF细胞和DF-1细胞上的增殖速度有差异,在DF-1细胞上的增殖速度要稍慢于CEF细胞,FC-126病毒在2种细胞上的增殖速度差异不大,因此在培养相同时间后测定PFU数,FC-126病毒在2种细胞上的滴度差异不大,而CVI988病毒在DF-1细胞上的滴度要稍低于CEF细胞,这与该病毒在DF-1细胞上增殖速度稍慢有直接关系。二次细胞技术应用于FC-126和CVI988病毒培养上,产毒量都有较大幅度的提高。在首次细胞形成单层后,实际上细胞之间还存在一定量的空隙,而二次细胞加入后,不一定能在原有的细胞单层上再形成另一细胞单层,但