雨生红球藻中虾青素提取方法的比较

雨生红球藻中虾青素提取方法的比较

1材料和方法1.1主要试验材料雨生红球藻：荆州天然虾青素有限公司；虾青素标准产品：西格玛。1.2仪器、试剂和仪器WD900SL23-2微波炉(经改造,附微波萃取系统):顺德市格兰仕电器实业有限公司;761CRT紫外可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;LD5-2A低速离心机:北京医用离心机厂;MA45赛多利斯水分测定仪、BS323S电子天平:北京塞多利斯仪器系统有限公司;HZQ-C空气浴振荡器:日本岛津有限公司;ALPHA1-4LD冷冻干燥机:德国MarinChrist公司;RE-300旋转蒸发仪:德国STUART公司;总抗氧化能力测定试剂盒:南京建成生物工程研究所;CaryEclipse荧光分光光度计:美国VARIAN公司。1.3测试方法1.3.1工艺路线1.3.1.微波萃取条件微波法参照文献[1]执行,破壁处理采用4℃环境下的研磨法,有机溶剂采用乙酸乙酯/乙醇(1/2,体积比)的混合液,微波萃取条件为4.5min、萃取功率540W,液料比220∶1。微波萃取后进行离心(3600r/min,15min),收集上清液,稀释定容,测定提取率。1.3.1.活性物质的提取低温研磨萃取法参照文献[2,7],并修改如下:准确称取一定量的雨生红球藻样品,置研磨器中加液氮研磨0.15min,重复1次,然后加入适量的乙酸乙酯/乙醇(1/2,体积比)的混合液于空气浴振荡器振荡提取3h,提取物进行离心(3600r/min,15min),收集上清液,稀释定容,测定提取率。1.3.1.提取率的测定碱提法参照文献[3],并修改如下:准确称取一定量的雨生红球藻,经4℃环境下的研磨法破壁后,用2mol/L的NaOH溶液回流10h,过滤后滤液用1mol/L的HCl调pH至2,然后离心(4600r/min,15min),收集砖红色沉淀物,稀释定容,测定提取率。1.3.2计算虾青素提取率虾青素提取率的计算同文献[1]的方法。采用SPSS10.0统计软件进行数据分析,结果以1.3.3总抗氧化能力测定微波法、低温研磨萃取法制得的虾青素提取物经真空浓缩→真空冷冻干燥→测定水分,以用于总抗氧化能力和清除羟自由基能力的测定;碱提法制得的虾青素沉淀物经真空冷冻干燥→测定水分,以用于总抗氧化能力和清除羟自由基能力的测定。1.3.3.1总氧化能力的测定采用Fe1.3.3.trs-hcl缓冲tkis法采用Fenton反应法。测定方法:以Fenton反应产生·OH。在一系列10mL的比色管中依次加入pH=7.5的Tris-HCl缓冲1.45mL,1×10式中:E为清除率,%;F采用SPSS10.0统计软件进行数据分析,结果以2结果与分析2.1虾青素提取率微波法、低温研磨萃取法、碱提法提取雨生红球藻中虾青素的效果见表1。由表1可知,微波法的虾青素提取率最高,低温研磨萃取法次之,碱提法最低。试验过程中发现采用低温研磨萃取法时,因为液氮的温度低于-180℃,挥发时使得雨生红球藻变脆而易于研磨;碱提法的提取率较低,可能在于NaOH溶液对虾青素结构的破坏以及过滤的影响。2.2碱法提取物总抗氧化能力的测定T-AOC是衡量机体总抗氧化能力的指标,它的高低代表机体的总抗氧化能力。由图1可知,虾青素总抗氧化能力与提取物的浓度呈正相关,随着提取物浓度的增加,其总抗氧化能力也增加;比较而言,碱提法提取物的总抗氧化能力最低,原因在于这种方法会造成虾青素结构的破坏,同时,由于碱提法加工过程需消耗大量酸碱,同时加工废水的污染也是很难解决的问题,因此认为这种方法不适宜于雨生红球藻中虾青素的提取;微波法提取物的总抗氧化能力稍低于低温研磨萃取法提取物,但随着浓度的增加,当达到500mg/L时,微波法提取物的T-AOC为299U/mL,低温研磨萃取法的T-AOC为302U/mL,此时已相差不大,同时结合表1可知微波法比低温研磨萃取法的提取率要高0.27个百分点,这也是微波法提取雨生红球藻的优越性所在。2.3不同提取方法对虾青素清除羟自由基能力的影响由表2可知,抗坏血酸、微波法提取物、低温研磨萃取法提取物、碱提法提取物对羟自由基都有一定的清除能力,且在试验范围内随着浓度的升高,其清除羟自由基的能力依次增强;比较而言,在试验的4个浓度下,清除羟自由基能力的强弱为组3(低温研磨萃取法提取物)>组2(微波法提取物)>组1(抗坏血酸)>组4(碱提法提取物),且各组与对照组(组1)比较,有高度显著差异;结合图1的分析可知,微波法提取物、低温研磨萃取法提取物和碱提法提取物清除羟自由基的能力和其总抗氧化的能力具有正相关,都是随着其浓度的增高而增强;微波法提取物和低温研磨萃取法提取物清除羟自由基能力差别不大,说明试验条件下的微波处理对虾青素提取物清除羟自由基能力影响不大,但结合表1可知,微波法比低温研磨萃取法的提取率要高0.27个百分点;在0.1mg/mL的浓度下,微波法提取物和低温研磨萃取法提取物比抗坏血酸的羟自由基清除率分别要高28.6和31.4个百分点,说明试验条件下这两种提取物要比抗坏血酸清除羟自由基的能力强;碱提法提取物对羟自由基的清除能力要弱,说明这种方法不适宜用于雨生红球藻中虾青素的提取,这和图1的分析结果一致。羟自由基是目前所知活性氧中最活泼的自由基,也是毒性最大的自由基,几乎能与活细胞中任何分子发生反应,故羟自由基的清除对维持生物机体正常的生理活动和抗衰老具有重要意义,羟自由基消除率是反映抗氧化作用的重要指标。由表2的分析可知,从提取量和提取物清除羟自由基的能力来看,微波法提取雨生红球藻中的虾青素具有一定的优越性。3微波法提取物与低温研磨萃取法提取物对于