常用分子生物学技术

北京八达岭长城1广西北海银滩海水浴场2杭州西湖涌金桥34第六章常用分子生物学技术（其次讲）5掌握：分子杂交技术的概念及基本原理Souther、Northern、Western印迹法的适用范围。聚合酶链式反应的概念及基本原理RNA干扰技术反义核酸及药物学习要求学习要求6第六章常用分子生物学技术第一节分子杂交技术其次节目的基因制备技术第三节基因敲除技术第四节RNA干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章P202）7核酸的分子杂交：

碱基序列互补的单链核酸，依据碱基互补原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。第一节分子杂交技术—基本原理81.Southern印迹杂交法：检测特异DNA片段2.Nouthern印迹杂交法：检测特异的RNA片段3.Western印迹杂交法：检测蛋白质第一节分子杂交技术–应用9第一节分子杂交技术–应用基因芯片在药物讨论方面的贡献用于药物作用新靶标的发现。进行药物作用机制的讨论。用于药物基因组学讨论，实施个体化治疗。进行毒理学讨论,用于药品平安性评价。

10第六章常用分子生物学技术第一节分子杂交技术其次节目的基因制备技术（PCR）第三节基因敲除技术第四节RNA干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章P202）11其次节目的基因制备技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）

是在试管中模拟发生于细胞内的DNA复制过程，故又称为基因的体外扩增法。是制备目的基因的主要方法之一。12其次节目的基因制备技术一、PCR技术的基本原理

以目的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的DNA片段为引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为底物，按半保留复制的原理，通过变性、复性和延长三个步骤完成新DNA的合成，并反复这一过程，实现目的DNA合成量的指数增长。13其次节目的基因制备技术二、PCR反应体系1、模板2、一对特异性引物3、热稳定DNA聚合酶4、dNTP5、缓冲液、阳离子14其次节目的基因制备技术三、PCR基本操作变性复性延伸15其次节目的基因制备技术

PCR循环：DNA模板变性引物与模板退火引物延长16第六章常用分子生物学技术第一节分子杂交技术其次节目的基因制备技术（PCR）第三节基因敲除技术第四节RNA干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章P202）17第六章常用分子生物学技术第一节分子杂交技术其次节目的基因制备技术（PCR）第三节基因敲除技术第四节RNA干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章P202）18第三节基因敲除技术基因敲除技术的概念产生及进展的意义几种常用的基因敲除技术19基因敲除(geneknockout)：

又称为基因打靶，是指从分子水平上将某基因去除或使基因失去活性,用以观察生物或细胞的表型变化，是讨论基因功能的重要手段。第三节基因敲除技术通过肯定的途径，使机体特定的基因失活或缺失的技术。20产生及进展的意义：讨论基因功能的方法主要有两种思路：增强表达,取得表达产物进行讨论；减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能。第三节基因敲除技术21进展及产生的意义：增强的表达不易真实反映基因产物的表达情况,较难于分析而逐渐被抛弃。基因表达的缄默相对而言更能为基因的功能供应直接证据,因而其技术不断得到进展和完善,其中最常用的就是基因敲除技术。第三节基因敲除技术22常用的基因敲除技术同源重组法插入突变法RNAi法第三节基因敲除技术23常用的基因敲除技术同源重组法插入突变法RNAi法第三节基因敲除技术24常用的基因敲除技术同源重组法：

应用DNA同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。第三节基因敲除技术25利用同源重组构建基因敲除动物模型的

基本步骤第三节基因敲除技术71.基因载体的构建2.获得ES,同源重组3.筛选重组ES4.表型讨论

26常用的基因敲除技术同源重组法插入突变法（基因捕获法）RNAi法第三节基因敲除技术是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。27利用随机插入突变进行基因敲除大规模的随机插入突变,它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因供应了可能。这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。

第三节基因敲除技术28RNA干扰引起的基因敲除

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种普遍的转录后基因缄默的机制,通过特异性地降解细胞内与其同源的mRNA,封闭内源性基因的表达来失活该基因，同样可以实现基因的敲除。第三节基因敲除技术29基因敲除技术的应用①．建立生物模型

在基因功能，代谢途径等讨论中模型生物的建立格外重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的讨论。第三节基因敲除技术30基因敲除技术的应用①．建立生物模型

第三节基因敲除技术裸鼠，此动物缺乏胸腺，不能生产T细胞，因此造成免疫缺陷。多用于肿瘤生物学讨论以及异体移植学讨论。31②.供应廉价的异种移植器官

器官来源稀有往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是由于异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。第三节基因敲除技术基因敲除技术的应用32③疾病的分子机理讨论和疾病的基因治疗

通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及讨论它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。

第三节基因敲除技术基因敲除技术的应用33

④免疫学中的应用

异源的抗体用于人体时会有肯定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。

第三节基因敲除技术基因敲除技术的应用34⑤改造生物、培育新的生物品种基因敲除技术则是遗传工程中的重大飞跃，它为定向改造生物，培育新型生物供应了重要的技术支持。第三节基因敲除技术基因敲除技术的应用35第六章常用分子生物学技术第一节分子杂交技术其次节目的基因制备技术第三节基因敲除技术第四节RNA干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章P202）36第四节RNA干扰技术2002年，RNA干扰被Science杂志评为本年度十大科学成就之首。37

小分子双链RNA干扰技术作为一项高效、高特异性地关闭特定基因表达的新技术,将为基因功能的讨论供应一种快速、简便的全新方法,同时也为功能基因组讨论与人类疾病的基因治疗带来革命性的变革。第四节RNA干扰技术382006年的诺贝尔生理学奖获得者AndrewZ.FireCraigC.Mello39第四节RNA干扰技术一、RNAi的定义及其发现二、RNAi的作用及其机制三、RNAi的应用40第四节RNA干扰技术一、RNAi的定义及其发现1.RNA干扰（RNAinterference,RNAi）：

是指在进化过程中高度保守的，由双链RNA（dsRNA）诱发的，同源mRNA高效特异性降解的现象。41

第四节RNAi—讨论史42转基因矮牵牛花的“基因缄默”现象

第四节RNAi—讨论史43

第四节RNAi—讨论史44秀丽隐杆线虫

第四节RNAi—讨论史45

第四节RNAi—讨论史4646第四节RNAi一、RNAi的定义及其发现二、RNAi的作用及其机制三、RNAi的应用47第四节RNAi----作用机制dsRNA：双链RNADicer：一种核酶siRNA：小干扰RNARISC：RNA诱导缄默复合体cleavage：断裂RNAi作用机制模式图48第四节RNAi外源基因整合入宿主细胞产生dsRNA49第四节RNAiRNAi的作用

是细胞为保护自身基因免遭诸如病毒入侵等损害，而实行的一种使入侵的外源基因失活、却不影响细胞内基因正常表达的保护性调控机制。50第四节RNAi一、RNAi的定义及其发现二、RNAi的作用及其机制三、RNAi的应用51第四节RNAi52第四节RNAisiRNA作为一种新型药物还存在的问题：1、siRNA的稳定性不佳，需进行适当的改进；2、药物转运的载体问题尚未解决；3、作用特异性不高。53第六章常用分子生物学技术第一节分子杂交技术其次节目的基因制备技术第三节基因敲除技术（自学）第四节RNA干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章P202）54反义核酸及药物一、概述二、反义核酸及药物三、反义核酸的应用55遗传信息传递规律的中心法则反义核酸及药物—

概述56正义链与反义链反义核酸及药物—

概述正义链反反义链571、反义核酸的定义依据碱基互补原理，用人工合成或生命有机结合成的特定互补的DNA或RNA片段，与目的序列结合，通过空间位阻效应或诱导RNA酶降解作用，在复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译水平上抑制或封闭目的基因的表达。反义核酸及药物—

概述581、反义核酸的定义依据碱基互补原理，用人工合成或生命有机结合成的特定互补的DNA或RNA片段，与目的序列结合，通过空间位阻效应或诱导RNA酶降解作用，在复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译水平上抑制或封闭目的基因的表达。反义核酸及药物—

概述59反义核酸及药物—

概述反

义

核

酸与模板链（功能链）互补，但不参加转录翻译的核酸分子模板链：DNA或者mRNA反义核酸：DNA或者RNA目标：抑制或封闭目的基因的表达60反义核酸及药物—

概述2、可作用的靶核酸区域：61反义核酸及药物—

概述mRNA5’端非翻译区：SD序列或RBSmRNA5’

端编码区：起始密码AUGmRNA5’端帽子形成位点mRNA

PolyA形成位点前体mRNA外显子与内含子的结合部位阻断mRNA的成熟及其向胞浆中转运2、可作用的靶核酸区域：62反义核酸及药物—

概述翻译水平

蛋白质的合成633.反义核酸的分类反义核酸及药物—

概述64反义核酸及药物一、概述二、反义技术及药物三、反义核酸的应用65反义核酸及药物反义技术根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成特定互补的DNA或RNA片段，抑制或封闭基因表达的技术。定义66

反义药物定义利用反义技术，设计出与致病有关的基因及其mRNA互补的反义“封条”（DNA或RNA片段），通过特异封闭这些基因不让它们表达或复制，从而达到治疗疾病的目的。反义核酸及药物67反义核酸及药物反义寡核苷酸细胞核目标基因转录细胞质核糖体翻译抑制mRNA断裂68

反义药物分类反义核酸及药物69第一代：反义DNA其次代：反义RNA第三代：肽核酸69反义DNA定义：人工合成的与待封闭基因的某一区段上互补的正常或化学修饰的DNA片段，用来抑制、封闭这一基因的表达。70反义DNA化学修饰的目的：更好地解决进入细胞的问题稳定、特异地和靶mRNA结合激活核酸酶降解mRNA71反义RNA定义：与目的RNA序列互补的RNA片段，通过配对碱基间氢键作用，与对应的RNA形成双链复合物而影响靶RNA的正常修饰、翻译等过程，从而抑制或封闭靶RNA的功能。来源：重组DNA技术、人工合成、人工修饰721定义在特定肽链上连接不同的碱基，即以类氨基多肽链代替核酸中的核糖磷酸骨架，并按一定的序列结合上标准的A、T、C、G碱基所形成的肽核酸，它能与互补DNA或RNA特异结合，从而封闭靶基因的表达。肽核酸―第三代反义寡核苷酸732特点与靶基因结合能力强稳定性好，易吸收在体内有内切酶活性和抑制端粒作用肽核酸―第三代反义寡核苷酸74第四节反义核酸及药物一、概述二、反义核酸及药物三、反义核酸的应用75抗肿瘤治疗对于反义药物而言，它能特异阻断肿瘤细胞内癌基因、原癌基因的表达，且不影响其他基因的正常表达。反义核酸为肿瘤治疗开辟了一条新的道路。反义核酸及药物---应用76Addyourtextinhere抗肿瘤治疗的方案

抑制癌基因的表达

用反义核酸技术在癌基因表达时与其mRNA特异性结合，阻断癌基因的表达，也可应用核酶降解癌基因mRNA。77反义核酸及药物---应用myc原癌基因家族---c-myc78反义核酸及药物---应用福米韦生（Vitravene，ISIS2922）：唯一被美国食品药品管理局（FDA）批准上市的反义核酸药物。79反义核酸及药物---应用科学讨论成果临床应用80高度特异的抑制某一mRNA的翻译，从而抑制相应基因的功能。不影响邻近基因的正常表达。反义药物应用的“瓶颈”

细胞内大量核酸酶对反义核酸的降解;

反义药物高浓度的使用带来的毒副作用的增加和治疗费用的增加。反义药物的优点及应用的“瓶颈”优点81第六章常用分子生物学技术（小结）82第六章常用分子生物学技术第一节分子杂交技术其次节目的基因制备技术第三节基因敲除技术第四节RNA干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章P202）83核酸的分子杂交：

碱基序列互补的单链核酸，依据碱基互补原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。第一节分子杂交技术—基本原理841.Southern印迹杂交法：检测特异DNA片段2.Nouthern印迹杂交法：检测特异的RNA片段3.Western印迹杂交法：检测蛋白质第一节分子杂交技术–应用85第一节分子杂交技术–应用基因芯片在药物讨论方面的贡献用于药物作用新靶标的发现。进行药物作用机制的讨论。用于药物基因组学讨论，实施个体化治疗。进行毒理学讨论,用于药品平安性评价。

86其次节目的基因制备技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是在试管中模拟发生于细胞内的DNA复制过程，故又称为基因的体外扩增法。是制备目的基因的主要方法之一。87

PCR循环：DNA模板变性引物与模板退火引物延长其次节目的基因制备技术88