雷公藤红素纳米混悬剂的制备及抗肿瘤作用研究

雷公藤红素纳米混悬剂的制备及抗肿瘤作用研究

据统计，在药物开发过程中，70%左右的候选人药物在制剂开发阶段被溶解和生物利用低。雷公藤红素（celastrol,Cel），又名南蛇藤素，1936年由赵承瑕首次从传统中药雷公藤的根部分离得到，是一种五环三萜类化合物（化学结构见图1)近些年来研究者已通过制剂手段来提高Cel的溶解度和生物利用度，降低毒性。如陈欣妍等1仪器、试药与培养基ZetasizerNanoZS型粒度仪，英国MalvernInstruments公司；MettlerToledoAL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ3200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器，北京恒丰长伟科技有限公司；DX-2700型X射线衍射仪，上海精密仪器仪表有限公司；UltiMate3000高效液相色谱仪，美国戴安有限公司；Biotek酶联免疫检测仪，美国伯腾仪器公司；JEM-1400透射电子显微镜，日本电子珠式会社；TecanInfiniteM1000PRO多功能酶标仪，力臻卓越（北京）科学仪器有限公司。Cel，质量分数>98%，成都阿克丁公司，批号CE-180402；泊洛沙姆188(P-188），中国西格玛有限公司，批号018K0029；色谱乙腈，赛默飞世尔科技有限公司，批号192855；无水乙醇，分析纯，北京化工厂，批号20190118；氧化锆球，直径为0.4～0.6mm，长沙华尊陶瓷材料有限公司；二甲基亚砜（DMSO），分析纯，北京化工厂。小鼠乳腺癌4T1细胞、人肝癌HepG2细胞、人皮肤恶性黑色素瘤SK-MEL-28细胞、人乳腺癌MCF-7细胞均购自北京协和医学院基础医学研究所细胞中心；RPMI1640、DMEM培养基，美国Hyclone公司，批号AD15805337、AD17218271；胎牛血清（批号2017488）、0.25%Trypsin-EDTA(1×），美国Gibco公司；青霉素和链霉素双抗，美国Hyclone公司，批号20170417。2方法和结果2.1cel-nsp是用微结合的方法制备的参照文献方法2.2饱和和药物晶体的制备沉淀法是基于“bottom-up”原理制备NSps的常用技术，该法通过将药物的良溶剂加入到可互溶的不良溶剂中，药物因过饱和而析出形成纳米尺寸的药物晶体，最后除去有机溶剂。具体操作如下：精密称取8mgCel溶于0.8mL无水乙醇中，再称取1mgP188溶于8mL去离子水中，在超声（25℃，250W）条件下将药物的醇溶液缓慢滴入到水相中，45℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂，即得CelNSps，记为Cel-NSps(b)。2.3样品测定和zeta电位分别取上述2种方法制备的Cel-NSps适量，适当稀释后用马尔文激光粒度仪测定其平均粒径、PDI及Zeta电位，每个样品平行测定3次，结果见图2。Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)的平均粒径分别为（215.7±0.7）、（133.1±0.8)nm,PDI分别为0.17±0.02、0.13±0.02,Zeta电位分别为（-18.0±0.6）、（-16.9±1.2)mV。2.4cel-nsps的电镜观察将上述2种方法制备的Cel-NSps稀释到100μg/mL，取6.0μL滴到300目铜网上，静置5min后用滤纸吸干多余液体，室温放置20min后，滴加6.0μL2%磷钨酸负染色液于铜网上，自然晾干，使用JEM-1400透射电子显微镜（TEM）观察Cel-NSps的形态，结果见图3。微型化介质研磨法制备的Cel-NSps(a)呈无规则形状，而沉淀法制备的Cel-NSps(b)呈球形，在TEM下2种纳米粒的粒径均小于动态光散射法（DLS）测得的粒径，这是因为TEM观测的是干燥粒子的粒径，而DLS观测的是水化粒子的粒径2.5sps法xrd采用真空冷冻干燥机将上述2种Cel-NSps冻干成粉末，然后与原料药（Cel）、稳定剂（P188）、Cel与P188的物理混合物（8∶1）一起进行XRD分析2.6密封放置稳定性研究将微量介质研磨法制备的Cel-NSps(a)和沉淀法制备的Cel-NSps(b)密封放置于4℃，分别在0、2、4、8、15、23、30d时取样测粒径，结果见表1,4℃放置30d纳米粒粒径无明显变化，且无肉眼可见的聚集和沉淀现象，说明2种方法制备的Cel-NSps在4℃下能稳定存在30d。2.7介质的稳定性研究2.7.1cel-nsps在生理介质中的粒径变化2.7.2研磨法制备的纳米粒中cel的剩余量将Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)分别与1.8%NaCl、10%Glu和PBS(2×）溶液等体积混合；与人工胃肠液、大鼠血浆按体积比1∶4混合，37℃孵育，并分别于0、2、4、6、8h取样100μL，用900μL色谱甲醇充分混匀后涡旋10min,HPLC测定Cel质量浓度，按下式计算Cel剩余量，剩余量=C从图5可以看出，研磨法制备的纳米粒中Cel在5%Glu、PBS和人工肠液中孵育8h后药物剩余量大于90%；而在0.9%NaCl、人工胃液和血浆中孵育8h后药物剩余量最低降到81%，推测和该纳米粒在0.9%NaCl中粒径增大、肠液低pH值以及胃蛋白酶和血浆中蛋白类成分和代谢酶有关。沉淀法制备的纳米粒中Cel在0.9%NaCl、5%Glu、PBS、人工胃液和人工肠液中孵育8h后剩余量大于90%；在血浆中剩余量降到84%，可能是受血浆中蛋白类成分和代谢酶影响。2.8cel-nsps的载剂量测量2.8.1条件1色谱柱为VenusilMPC2.8.2样品制备及色谱条件考察精密称取一定量的Cel对照品，用色谱甲醇溶解，按“2.8.1”项色谱条件进样，观察峰形、对称性及有无杂质峰干扰。同时，按照“2.2”项方法制备Cel-NSps和不含药的空白NSps，用色谱甲醇稀释后按照上述色谱条件进样，并记录相应色谱图，结果见图6。Cel的保留时间为14.3min，峰形对称，无拖尾；空白纳米粒在14.3min未出峰，说明辅料对Cel的检测没有干扰，专属性良好。2.8.3标准曲线的构建参照文献方法2.8.4进样和进样的确定取“2.8.3”项下质量浓度为5、50、100μg/mL的Cel溶液于1d内重复进样5次，考察日内精密度；日间连续进样5d，考察日间精密度。结果表明，各质量浓度的RSD值均小于5%，表明此方法的精密度良好，符合含量测定的要求。2.9外部释放研究采用透析袋扩散法考察Cel-NSps的体外释放情况2.10外细胞毒性试验将生长至对数期的4T1、HepG2、SK-MEL-28和MCF-7细胞以每孔8×103不同药物中cel-nsps的体外释放比较微型介质研磨法是对传统介质研磨法的改良，所需原料药较少，更适合前期在实验室的制剂处方及工艺研究。此外，该方法可以大大提高药物的活性，操作简单，工艺稳定，且无需使用有机溶剂，避免了有机溶剂残留造成的环境污染和机体毒性，但是该方法制备的纳米粒稳定性较差药物晶型可能影响药物的释放、药效和安全性，研究者应关注制备过程中药物晶型的改变，一般来说介质研磨法可以保持药物原有的晶型，而沉淀法容易造成药物晶型的转变2种方法制备的Cel-NSps，药物、辅料、药载比都相同，因制备方法不同，导致纳米粒在生理介质中的粒径变化和药物在纳米粒中的存在形式不同。难溶性药物的纳米粒在生理介质中的粒径，有时和在纯水中相近，有时会比在纯水中略大，有时粒径会增大很多甚至出现聚集沉淀。这种变化与药物本身的性质、辅料性质、纳米组装方式，纳米粒的电位、水化层和表面性质，以及生理介质的离子强度都有关系，迄今尚无形成一套理论能够解释不同药物不同辅料的纳米粒在生理介质中的粒径变化。介质研磨法制备的纳米粒粒径偏大，在人工胃液中粒径增大较多；沉淀法制备的纳米粒粒径较小，在各种不同介质中均较稳定。这可能是由于沉淀法制备的纳米粒呈球形，制备过程中稳定剂P188能更加均匀地覆盖在纳米粒表面；而研磨法制备的纳米粒形状不规则，稳定剂吸附不如沉淀法。介质研磨法通常不改变药物的晶型，Cel依然是以结晶状态存在；而反溶剂沉淀法的制备过程中，药物溶解成小分子后再自组装成纳米大小的颗粒，有时会保持原来的结晶形式，有时会形成能量更高的无定形态，而本研究中，Cel用反溶剂沉淀法制备的纳米粒为无定形状态。药物存在形式的不同，导致体外释放上的不同。在完全相同的条件下，微量介质研磨法制备的Cel-NSps(a)，在144h内呈匀速、平稳、缓慢的释放；而反溶剂沉淀法制备的Cel-NSps(b)，因无定形态处于亚稳定的高能状态，故先经历1个为期48h的快速释放相，然后是接近坪值的非常缓慢的慢释放相。但2种纳米粒的体外累积释放都远远超过Ce的物理混悬液。体外细胞毒性实验为下一步体内药效考察建立动物模型提供了参考依据，从MTT实验结果来看，Cel纳米粒对4种细胞的IC综上所述，本研究通过微型介质研磨法和反溶剂沉淀法制备了粒径小、稳定性好、载药量高、可用于口服或静脉注射的Cel-NSps，且制备方法简单，易于工业化大生产，有望成为继紫杉醇之后的新一代天然抗肿瘤药物将Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)分别与1.8%NaCl、10%Glu和磷酸盐缓冲液（PBS)(2×）溶液等体积混合；与人工胃肠液、大鼠血浆按体积比1∶4混合，37℃孵育，并分别在0、2、4、6、8h取样测粒径，观察有无聚集、沉淀，结果见图5。与上述生理介质共孵育8h后，Cel-NSps(a)在PBS溶液中粒径变化较小，且无任何浑浊、沉淀现象，说明CelNSps(a)在PBS中稳定性较好，而在0.9%NaCl、5%Glu和人工肠液中，Cel-NSps(a)的粒径有增大趋势，但是无沉淀现象，说明Cel-NSps(a)在这3种介质中稳定性一般，而在人工胃液中Cel-NSps(a)粒径由215nm增大到919nm，说明Cel-NSps(a)在人工胃液中不能稳定存在，可