外源性DNA检测方法介绍

外源性DNA检测方法介绍IntroductionofexogenousDNAdetection汇报人：李爽日期：2016年5月6日目录01020304外源性DNA检测的意义国内外残留DNA的标准规定常用检测方法总结外源性DNA检测意义重组蛋白药抗体药疫苗工程菌动物细胞株传染性风险致瘤性风险生物代谢外源性DNA国外残留DNA标准的规定非口服的生物制品DNA残留量为10ng每人份剂量生物制品DNA残留量不高于100pg大剂量制品放宽到10ng每人份剂量对于残余DNA的限度规定为不超过10ng每人份剂量，但针对个别疫苗会有不同WHOFDA欧洲药典010203我国残留DNA标准的规定产品来源产品名称细胞DNA标准国产疫苗狂犬病疫苗Vero100pg/剂量肾综合征出血热疫苗Vero100pg/剂量甲型肝炎灭活疫苗Vero100pg/剂量乙型脑炎疫苗Vero10pg/剂量乙型肝炎疫苗CHO10pg/剂量进口疫苗小儿麻痹疫苗Vero10pg/剂量狂犬病疫苗Vero10ng/剂量治疗性生物制品干扰素、G-CSF、GM-CSE、白介素等E.coli/Yeast10ng/剂量EPO、单克隆抗体等CHO100pg/剂量我国部分疫苗及治疗用生物制品残余DNA标准常用检测方法01020304定量PCR法荧光染料法阈值法分子杂交法定量PCR法（实时荧光定量核酸扩增检测系统）原理基于PCR扩增时,在加入引物的同时加入特异性的荧光探针，当引物引导DNA聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA聚合酶切断结合在目标DNA上的探针染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。通过实时监控PCR体系中的荧光信号,对样本中初始模板进行定量分析。优点：时间短、特异性强、灵敏度高缺点：成本高、设计引物、特定目标Taqman探针法阈值法基于两种DNA序列非特异性蛋白生物素标记的单链DNA结合蛋白结合尿素酶的抗单链DNA的抗体阈值法膜放入含有尿素溶液的检测仪器中尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2，导致溶液pH值发生变化并被仪器记录DNA变性成单链单链DNA、DNA结合蛋白、DNA抗体共同形成序列非特异的复合物通过生物素标记的膜，亲和素-生物素结合把DNA复合物固定在膜上优点：时间短、灵敏度高缺点：非特异性、成本高荧光染料法原理：荧光染料分子直接与双链DNA结合，在波长为480nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测优点：操作方便、时间短缺点：不能检出单链DNA、荧光信号易受干扰分子杂交法INSERTTEXT0102杂交双链DNA变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下与特异性、地高辛标记的探针重新结合成为双链DNA基本原理：双链DNA变性后吸附在固相膜上与标记好的DNA探针杂交结合，并在膜上对应位置显现斑点。免疫检测使用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫反应，然后与显色底物NBT/BCIP发生显色反应分子杂交法DNA探针是被生物素、放射性同位素、地高辛和荧光等随机掺入标记的与目的基因互补的DNA片段地高辛(Digoxigenin,DIG)又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子DIG通过一个含有11个碳原子的空间臂与尿嘧啶核苷酸相连，形成DIG-11-dUTP，它可以通过随机引物标记，缺口平移，PCR等掺入到DNA探针中分子杂交法DNA模板变性之后与随机引物杂交，在klenowDNA聚合酶的作用下DIG-11-dUTP掺入新链中随机引物法标记DNA探针分子杂交法供试品处理杂交免疫检测*蛋白酶K预处理*Tris-饱和酚抽提*沉淀DNA*变性*点膜*预杂交*杂交*抗体结合*显色（NBT/BCIP）优点：有特异性、稳定性较好缺点：操作繁琐、半定量分析总结四种检测方法竞争分析定量PCR法阈值法荧光染料法分子杂交法灵敏度<1pg2pg300pg10p