自己根据实验总结的Western blot

Westernblot一、试剂配制1）细胞裂解液：组分：Tirs-base（50mM），EDTA（10mM），Nacl（100mM），Triton-100（1%）Tirs-baseEDTANaclTriton-1000.3025g0.146g0.2925g0.5ml用双蒸水定容至50ml，于4℃保存。2）PMSF：PMSF0.0174g溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。注：PMSF工作浓度为0.1-1mM，此液为100mM母液，使用前加入细胞裂解液中，终浓度为1mM。PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣服应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于4℃。pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为35分钟（James，1978），这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。3）1.5MTris-basePH8.8：Tris-base18.17g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至96ml，调PH时约需4ml浓HCL。4）0.5MTris-basePH6.8：Tris-base6.05g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至97ml，调PH时约需3ml浓HCL。5）10%SDS：SDS10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，定容至100ml，注：由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去。6）30%Acry/bis：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，双蒸水定容至100ml，37℃助溶，-4℃保存。注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。7）考马斯亮蓝G250工作液：考马斯亮蓝G250无水乙醇磷酸0.01g5ml10ml用双蒸水定容至100ml，过滤4℃保存。8）10mg/ml牛血清白蛋白（BSA）母液：BSA0.01g，生理盐水1ml，-20℃保存，使用时稀释为1mg/ml工作液。9）5×SDS凝胶上样缓冲液（LoadingBuffer）：组分：1MTris-basePH6.8（250mM），SDS（10%），溴酚蓝（0.5%），甘油（50%），β-巯基乙醇（5%）1MTris-basePH6.8甘油SDS溴酚蓝1.25ml2.5ml0.5g0.0025g用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。10）TBST缓冲液：Tris-baseNaclTween-203g8g1ml用双蒸水定容至1000ml，调PH为7.4,4℃保存。11)10%过硫酸铵（APS）：APS0.1g溶于1ml双蒸水中，4℃保存一星期有效，最好现配现用。12)10%浓缩胶（7.5ml/两块胶）：双蒸水1.5MTris-basePH8.810%SDS10%过硫酸铵（APS）TEMED（毒）30%Acry/bis（毒）2.85ml1.9ml75ul75ul5ul2.6ml依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。13）5%浓缩胶（5ml/两块胶）：双蒸水0.5MTris-basePH6.810%SDS10%过硫酸铵（APS）TEMED（毒）30%Acry/bis（毒）2.1ml0.38ml30ul30ul3ul0.5ml依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。14)电泳缓冲液：Tris-base甘氨酸SDS1.515g9.4g0.5g用双蒸水定容至500ml，由于SDS溶解过程中会产生泡沫，因此定容之后再加，现配现用。转移缓冲液：Tris-base甘氨酸甲醇3.03g14.4g200ml制胶完成后配制，用双蒸水定容至800ml，然后放入4℃冰箱预冷，使用时再加入200ml甲醇。16）5%牛奶封闭液：伊利脱脂奶粉0.5g，TBST10ml，4℃保存，最好现配现用。组织蛋白提取吸取792ul细胞裂解液与8ulPMSF，充分混匀置于匀浆器里放在冰上备用。打开4℃低温高速离心机，预冷。称取0.05g组织样品于匀浆器中，然后加入匀浆器中研磨。将匀浆液移入2mlEP管中，冰上裂解30min。1,2000r/min，4℃离心15min，取上清即为蛋白，放入-80℃保存。蛋白浓度测定CBB双蒸水1mg/mlBSA蛋白样品空白管2.4ml40ul--标准管2.4ml-40ul-待测管2.4ml36ul-4ul蛋白样品浓度=10×蛋白样品OD值/标准蛋白OD值，单位为ug/ul。蛋白灭活根据浓度计算出上样50ug蛋白所需体积分装于0.5mlEP管中，然后加入1/4体积的5×SDS凝胶上样缓冲液，95℃高温煮沸5min，-80℃保存，最好现配现用，可临时于-20℃保存。Westernblot操作过程制胶：将制胶板固定好，按上述方法配好分离胶，充分混匀后倒入制胶板中，确保胶不漏，然后用双蒸水封闭，室温静置30min（配制电泳缓冲液及转移缓冲液），凝固后倒出双蒸水，用滤纸吸干，配置好浓缩胶，倒入制胶板中，然后插入梳子，室温静置30min（灭活蛋白）备用。电泳：组装好电泳仪，红对红黑对黑，从密封的中间区域倒入电泳缓冲液，至漫过周边下方的金属丝，然后拔出梳子，加入蛋白样品及蛋白Maker。插上电源，浓缩胶区域电压设为60V（约30min），分离胶区域电压设为100V(约1h)，具体时间根据LoadingBuffer把握。转膜：将预冷后的转膜缓冲液中加入200ml甲醇混匀后倒置在托盘中，裁剪4张稍微小于转膜海绵的滤纸，于转膜液中浸泡15min，同时取出胶，切割目的胶片段，置于转膜液中，裁剪与之大小相同的NC膜于转膜液中浸泡15min。将转膜夹板置于托盘中，白色板在下，依次放置：白色夹板—海绵—2层滤纸—NC膜—胶—2层滤纸—海绵—黑色夹板。将夹板固定好后放入转膜槽中黑对黑白对红，接通电源，电压为100V，电流为250mA，时间为2h。注：转膜过程在冰里操作。封闭：将NC膜取出，在Maker端剪个小角，与胶接触面标记为上，然后置于10ml5%牛奶封闭液中，室温振荡摇匀1h。洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。一抗孵育：按1:1000比例用5%牛奶封闭液配制一抗GAPDH10ml，4℃振荡摇匀过夜。或室温振荡2h，4℃过夜，一抗可回收重复利用。洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。二抗孵育：按1:5000比例用牛奶封闭液配制二抗10ml，室温振荡摇匀1h。洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。ECL显色：取A液与B液各500ul即为ECL显色液（1ml），混匀备用。暗室操作，所需准备的物品包括：200ul枪