马立克氏病病毒meq基因序列分析

马立克氏病病毒meq基因序列分析

马立克病（md）是马立克病病毒（mdv）引起的一种鸡肿瘤组织增生疾病。它的特点是鸡的外周神经、膜充血和内脏器官形成肿瘤。1材料表面1.1检测疾病的文件肝脏病料采自贵阳市某养殖场饲养的疑似MD矮脚黄鸡，保存于贵州大学预防兽医学实验室(-80℃冰箱)。1.2质粒提取和细胞系统琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒[购自天根生化科技(北京)有限公司]，HiFi-ScriptcDNA第一链合成试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司)，质粒提取试剂盒、2×ESTaqDNAMix、pMD19-TVector、DL2000DNAMarker、DL5000DNAMarker[购自宝生物工程(大连)有限公司]，大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自上海碧云天生物技术有限公司)。1.3凝胶成像仪和pcr检测电泳槽(DYCZ-HOB型)、电泳仪电源(DYCZ-8C型)(购自北京市六一仪器厂)，SY-GENE电泳凝胶成像仪(购自GENE公司)，多功能梯度PCR仪(VeritiTm96-WellThermalCycler)(购自ABI公司)，37℃隔水式电热恒温培养箱(BD53)(购自BINDER公司)。2方法2.1mdvmeq、引物、材料参考GXY2株meq基因(GenBank登录号:EF546430)设计MDVmeq，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息见表1。2.2mdv核酸pcr检测根据病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书分别提取总DNA和总RNA，再根据HiFi-ScriptcDNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录为cDNA备用。使用MDVmeq特异引物对核酸样品进行PCR扩增。总反应体系20μL:上、下游引物(10mol/μL)各1.0μL,2×ESTaqDNA聚合酶10μL，核酸2μL,ddH2.3菌株转化细胞的培养将MDVmeq的PCR产物进行胶回收，连接到pMD19-T载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化细胞接种于LB固体培养基，37℃培养箱中倒置培养16～24h至长出菌落，挑取6个单菌落接种于含氨苄青霉素(50mg/mL)的LB液体培养基，于37℃170r/min培养12～16h。取培养的克隆菌液2μL进行PCR鉴定(反应体系及条件同2.2)，提取阳性克隆菌液质粒送华大基因测序。2.4遗传进化分析将测序结果与GenBank中已有序列进行比对，利用MegAlign软件分析其同源性、氨基酸缺失位点，并构建遗传进化树。参考毒株信息见表2。3结果3.1mdvmeq基因检测由图1可见:经PCR扩增，于1020bp处出现MDVmeq基因特异扩增条带，长度与预扩增片段相符，表明病鸡存在MDV感染，将该片段命名为MDVGZ2019meq。3.2pcr确定了sdmeq基因克隆菌液的pcr结果由图2可见:各克隆菌液在1020bp处均出现特异扩增条带，与目的基因大小相符。3.3mdqldvgz19meq基因同源性分析测序结果显示MDVGZ2019meq基因全长1020bp，共编码339个氨基酸，将其与GenBank登录的10株MDV参考株的meq基因进行核苷酸序列、推导氨基酸序列同源性比对。由图3可见:MDVGZ2019meq基因与参考毒株的核苷酸同源性为98.7%～99.8%。其与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的同源性最高(99.8%)，与国内强毒MDV分离株J-1株、美国特超强毒MDV分离株648A株的同源性最低(98.7%)。由图4可见:MDVGZ2019meq基因与参考毒株的推导氨基酸同源性为96.7%～99.4%。其与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的同源性最高(99.4%)，与荷兰温和型MDV分离株CVI988株的同源性最低(96.7%)。3.4q基因与mtk、n株、328a株的亲缘关系由图5可见:MDVGZ2019meq基因与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的亲缘关系最近，与美国特超强毒MDV分离株TK株、N株、648A株的亲缘关系最远。3.5突变位点选取将MDVGZ2019meq基因推导氨基酸序列与GXY2等10株参考毒株进行比对，发现共有5个突变位点，分别为第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A)(见图6)。除第63位氨基酸突变是MDVGZ2019meq基因所独有以外，其余突变位点与国内特超强毒MDV分离株GXY2株完全一致。4讨论5mdvdgz19meq基因测序本试验从疑似MD贵州矮脚黄鸡的肝脏病料中扩增出MDVmeq基因，并进行克隆及序列分析，发现该基因长度为1020bp，可编码339个氨基酸;与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的核苷酸序列同源性高达99.8%;存在5个氨基酸突变位点，除第63位突变是MDVGZ2019meq基因所独有以外，其余突变位点均与国内特超强毒MDV分离株GXY2株完全一致，推测其为强毒株，具体致病性强弱还需进一步研究。4.1meq基因是MDV-1中特有的主要