白纹伊蚊沃尔巴克氏体的丰度和遗传相关性分析

白纹伊蚊沃尔巴克氏体的丰度和遗传相关性分析

沃尔巴克属的动物属于变形动物科，属于变形动物科，是赫蒂克和沃尔巴克科的主要成员。海南省属于热带海洋气候，年平均气温24.2℃、平均降雨量1684mm，自然条件非常适宜各类病媒生物尤其是蚊类的生长和繁殖1材料和方法1.1实验试剂和仪器功夫小帅诱蚊灯（LTS-MO2，武汉吉星医疗科技有限公司）、MightyPrepreagentforDNA试剂盒[Cat#9182，宝生物工程（大连）有限公司]、DNeasyBlood&TissueKit抽提试剂盒（QIAGEN:69506，北京诺博莱德科技有限公司）、SCIENTZ-48高通量组织研磨仪（SCIENTZ-48，宁波新芝生物科技股份有限公司）、基因扩增仪（BiometraTone96，德国耶拿分析仪器股份公司）、解剖镜（AE2000，麦克奥迪实业集团有限公司）、蚊笼、吸蚊器、75%乙醇溶液、镊子等。1.2采集、鉴定和样品处理蚊种的采集地点根据文献报道1.3pcr反应模板将1.2步骤保存的单只蚊的蚊腿从95%乙醇溶液取出放入1.5mlEP管中，取100μl的MightyPrepreagentforDNA添加到蚊腿被液体浸没，95℃水浴加热10min,12000r/min离心2min(13201×g），取上清液作为PCR反应的模板。依据参考文献使用多细胞无脊椎动物细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因的通用引物1.4昆虫中肠联合实验从-80℃取出1.2步骤保存的白纹伊蚊中肠样品，每个地点使用30只中肠进行实验，每10只蚊虫中肠合并为1组，重复3组。采用DNA提取试剂盒（QIAGEN:69506）提取合并蚊虫中肠的总微生物基因组DNA,-80℃保存，备用。1.516个rna测量与生物信息分析应用HiSeq4000系统对中肠微生物组16SrRNA基因的V3-V4高变区高通量测序1.6统计分析应用Excel2019软件整理数据，使用SPSS21.0软件分析数据，计数资料分析采用率或构成比之间的χ2结果2.1蚊种鉴定结果蚊种的COⅠ基因PCR产物条带大小约为650bp，其各地代表样品的电泳结果如图1所示，产物送北京博云华康基因科技有限公司测序，NCBI序列比对鉴定，结合形态学鉴定可确定进入中肠微生物DNA高通量测序的蚊种均为雌性白纹伊蚊，各地区代表蚊种序列的GenBank登录号为：海口（MT890464）、屯昌（MT906353）、三亚（MT906351）、文昌（MT906350）、定安（MT890489）、陵水（MT906156）、乐东（MT890465）、五指山（MT906352）。依据蚊种鉴定结果合并中肠，10只/组、重复3组。2.2沃尔伯克体丰度测试结果2.3遗传距离的确定通过MEGA7.0软件对各采样点抽取的序列分析可见，以乐东县下红新村与海口市昌旺村遗传距离最大（0.045），亲缘关系较远的还有乐东县下红新村与三亚市赤草村、五指山市草办村A、文昌县城区、屯昌县枫木鹿场，海口市昌旺村与五指山市草办村B，五指山市草办村A与屯昌县枫木鹿场，两两遗传距离均>0.030，而陵水县吊罗山与定安县福基田村、文昌县雨坛村与文昌县加保村的序列完全相同，具体遗传距离见表2。3沃尔巴克氏体分布沃尔巴克氏体是一种母系遗传的革兰阴性菌，66.00%的节肢动物中有感染在此次采集的样品中，不同区域的蚊虫肠道感染的菌群丰度比，运用χ本研究使用的是16SrRNA的V3-V4高变区，在9个变异区中进化速度相对适中，能较好地满足属种的鉴定综上所述，海南省的白纹伊蚊中肠内，大部分地区的沃尔巴克氏体作为优势菌种，但也出现乐东县和五指山市感染率极低的情况，或许这2个地区为基于CI为基础发展的IIT技术研究可提供便利。通过统计学分析发现，不同地区白纹伊蚊沃尔巴克氏体构成比在肠道微生物的构成差异有统计学意义，遗传距离显示不同地区存在菌株的交换，各地区菌株存在遗传多样性。应指出的是本研究采样未全域覆盖，以上研究结果并不排除在其他未覆盖地区存在不同或与现有结果不一致的情况，增加采样区域，研究结果能更具代表性。利益冲突无应用HiSeq4000系统平台对16SrRNAV3-V4区高通量测序，3个组的数据通过质控分析处理后，合并分类至属，沃尔巴克氏体各地区丰度分布见图2。沃尔巴克氏体的丰度占比以定安县最高（84.67%），其次为三亚、陵水、海口、屯昌和文昌市（县），分别占80.34%、68.77%、56.89%、38.28%和31.57%，丰度较低的为乐东县和五指山市，分别占1.50%和0.01%。而五指山市的肠球菌属占38.40%，乐东县的肠杆菌属占26.93%，为优势菌属，同时占比较高的还有乐东县的嗜热杆菌属（Ther