布氏锥虫感染pcr检测方法的建立

布氏锥虫感染pcr检测方法的建立

蠕虫是血内寄生虫，主要包括环磷酰亚锥形虫、环磷酰亚锥形虫、环磷酰亚锥形虫和克虏提克蠕虫。锥虫病是一种人兽共患病，也是一种重要的热带寄生虫病，主要流行于非洲和南美洲1材料和方法1.1材料表面1.1.1小鼠养殖，分离布氏锥虫由中山大学寄生虫学教研室提供，由小鼠繁殖，液态氮保存；小鼠由中山大学实验动物中心提供。伊氏锥虫和克氏锥虫由中国农科院上海兽医研究所寄生虫研究室提供。1.1.2主试剂DNA提取试剂盒（KG203）购自天根生化科技有限公司，dNTPs和Taq聚合酶均由深圳金赛途生物科技有限公司提供。1.2方法1.2.1大鼠血样1.2.2pcr方法的配置1.2.2.引物设计，靶基因表达在GeneBank中检索布氏锥虫序列，选择42个亚型毒株，用PrimerPremier5.0软件设计引物，靶基因为表达位点相关基因（expressionsite-associatedgene,ESAG），序列号：FJ416612，上游引物：5’-AGAGGCGGTTTGCGTATTGG-3’，下游引物：5’-GGCAGGGTCGGAACAGGAGA-3’，扩增片段249bp。1.2.2.2pcr扩增反应PCR反应体系50μl包括MgCl1.2.3pcr方法的验证1.2.3.最低检测限的确定将10μg/μl布氏锥虫体DNA梯度稀释至1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl及0.1pg/μl，分别作为模板，PCR扩增后确定方法的最低检测限。1.2.3.2.特异性试验分别以布氏锥虫、伊氏锥虫及克氏锥虫DNA各1μl为模板，以无菌去离子水作为阴性对照，并与镜检法进行比较。1.3统计方法选用SPSS17.0软件处理数据，计数资料以率（%）表示，组间比较行卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1pcr扩增结果以布氏锥虫DNA行kDNA片段PCR扩增锥虫rDNA，结果显示布氏锥虫为249bp片段，见图1。2.2a片段dna检测DNA序列分析两条特异引物间序列为布氏锥虫kDNA片段序列，10倍比稀释梯度法检测结果示可检测到100pg/μlDNA（图2）。只有布氏锥虫扩增到249bp片段，其他两种锥虫均未见目的条带（图3）。2.3cr法pcr扩增结果感染布氏锥虫3d后的小鼠，有29只小鼠尾血中用PCR法扩增到目的片段，准确率为96.67%(29/30）；镜检有24只阳性，准确率80.00%(24/30）。PCR法的准确性高于镜检，差异有统计学意义（χ2.4布氏锥虫dna分别用建立的PCR方法扩增10株布氏锥虫、伊氏锥虫及克氏锥虫DNA,10株布氏锥虫全部扩增到目的片段，而10株克氏锥虫均为阴性，但有1株伊氏锥虫也扩增到条带（表1）。3pcr扩增布氏锥虫片段的可行性布氏锥虫多通过哺乳动物传播，也可以通过输血传播，其传播媒介主要为吸血蝇、虻、血鞭毛原虫本研究建立的PCR方法可检测到100pg/μl布氏锥虫DNA，敏感性较高，高于传统的显微镜镜检，且差异有统计学意义。本研究设计的引物为避免错配，将5’端和中间区设计为G，并在最后5个核苷中加入3个A或T，避免3’富含GC，提高了特异性本研究建立的PCR方法能成功扩增布氏锥虫目的片段，而克氏锥虫呈阴性，与伊氏锥虫存在交叉反应，但