实习二电离辐射细胞存活克隆实验结果分析-北京大学医学部课程中心

PAGEPAGE9放射生物学实习二细胞克隆（集落）形成法评估电离辐射细胞增殖性死亡目的要求目的：了解细胞克隆（集落）形成法检测细胞存活能力的方法，熟悉细胞存活分数（SF,survivalfraction,inunitof%）与受照剂量（D,dose,inunitofGy）之间剂量－效应的关系，熟悉与细胞存活剂量效应模型曲线结果处理有关的软件及使用方法，掌握细胞存活模型曲线的绘制及重要参数的计算。要求：1，计算细胞接种效率(PE,plantingefficiency)；2，应用SPSS软件测算单击多靶模型下细胞存活曲线的n、k估计值，评价模型曲线的拟合优度；3，根据n、k估计值进一步计算D0、Dq和D37等参数，以及某一化学增敏剂或处理因素的增敏比(SER,sensitiveenhancingratio)；4，利用EXCEL软件绘制细胞存活剂量效应的模型曲线。实验原理放射生物学中细胞受电离辐射照射后，受照细胞既可以呈现即刻死亡，也可能延迟一段时间后才表现出死亡，即增殖环节出现的细胞死亡。这是因为有些受照细胞形态上仍然保持细胞结构的完整，同时细胞还具有制造蛋白质、合成DNA，甚至再经历一次或数次细胞的有丝分裂，但最终还是发生了细胞的变性死亡,这种并不立即表现出死亡的部分就称为细胞增殖性死亡。细胞增殖性死亡是放射生物学研究中最具特色的一类细胞死亡。细胞增殖性死亡与细胞凋亡是两个不同的概念，有关细胞增殖性死亡的分子生物学机制目前尚未完全清楚。一般而言,细胞增殖性死亡是不能经MTT实验、LDH漏出实验、或台盼蓝拒染法等加以检测。放射生物学上，人们通常采用细胞克隆（集落）形成试验来检测经电离辐射照射后，细胞在克隆性细胞增殖能力上的变化。一个存活的细胞克隆（集落）代表的是电离辐射细胞经一段时间（大约10天）培养后，由独立分散的单个健在细胞直接分裂、增殖，尔后形成具一定细胞数量的群体（通常含50个以上细胞）。目前已有很多科学家正在努力探索用MTT实验方式达到简化或模拟细胞增殖性死亡的实验结果，从而用于药物辐射抵抗能力的筛选。显而易见，细胞死亡的程度与细胞受照剂量的大小直接相关，但是在放射生物学中细胞死亡程度更多采用细胞存活分数来表示。哺乳类细胞受照后，单击多靶数学模型能较好地说明这种细胞存活与受照剂量之间相关性的数学规律。因此实践中一般就采用单击多靶数学模型对细胞存活分数与受照剂量各自之间的原始数据进行拟合，从而获得细胞存活曲线的数学表达式及其一些重要的参数如D0、Dq、k和n等。在单击多靶细胞存活模型中，Dq值反映了细胞抵抗电离辐射修复亚致死性细胞损伤能力的大小。由此，人们还可以就未经处理的对照组与放射敏感剂处理组Dq值进行比较，求出两组之间Dq的比值，即获得该放射敏感剂的辐射增敏比SER。细胞存活分数（SF）与辐射剂量之间数学模型的建立哺乳类细胞受不同剂量电离辐射照射后，细胞存活的规律大多是符合单击多靶细胞模型，即根据实测细胞存活分数的原始数据对受照剂量进行非线性回归性拟合，获得单击多靶细胞存活模型及其相关参数，如k、n、D0、Dq和D37。其中，k为细胞存活曲线的钝化常数，其值由拟合方程直接给出；n为外推数，理论上代表靶的数目，数值大小也是由拟合方程直接给出；D0为平均致死剂量，理论上D0是使每个细胞平均被击中一次所需要的辐射剂量，数值上D0＝1/k；Dq为准阈剂量，Dq表征修复亚致死损伤的能力，即克服单击多靶曲线中“肩宽”所需要的剂量，数值上Dq＝lnnxD0；D37是细胞存活分数相应于37%时所需要的辐射剂量，在单击多靶模型中D37＝D0+Dq。参数k、n、D0、Dq和D37等在单击多靶细胞存活模型曲线中的位置见下图。D0、Dq、D37以及SER值简单计算，公式如下。实验材料、设备条件与细胞存活曲线实验的基本步骤实验材料与设备条件人宫颈癌HeLa细胞及其培养基；钴60伽马射线源；软件包括数学模型拟合用SPSS软件，曲线绘制用EXCEL软件。细胞准备与电离辐射的照射细胞照射前，取处于对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单个细胞悬液，计数细胞密度。设不加照射处理的1个对照组，以及0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0Gy6个照射组（单纯照射对照组）。每增加一个受试化学增敏剂（仅一个剂量）处理时，都应设1个含该化学增敏剂但未经照射的对照组和6个含该化学增敏剂但经不同剂量照射的照射组，称为增敏剂处理照射组。25cm2培养瓶中，按0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0Gy剂量分组，每瓶对应分别接种细胞600、600、600、1000、4000、8000、10000个细胞，每组均设3个实验平行，37℃，5%CO2下添加培养基进行正常培养。细胞接种6－12小时后，细胞开始贴壁生长，然后根据需要将将培养细胞转移至钴源室接受不同剂量（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0Gy）的电离辐射的照射处理。应当注意的是实验前应当预先计算好不同照射剂量时各组相应的照射时间、照射摆放距离等照射条件，做好瓶子上的标记，同时还要做好预防培养细胞照射过程中的再次污染问题。细胞培养、克隆计数与平均存活分数（SF）的计算将接受照射后的细胞放回细胞培养箱继续培养，每三天更换一次新鲜培养基，待培养至8－10天后弃尽培养基，用0.5%结晶紫对贴壁细胞染色。统一一个克隆（集落）大小的标尺判断标准，计数并记录不同照射剂量下各组培养瓶中所有存活的细胞克隆个数。根据未经照射的对照组细胞克隆数目与实际接种的细胞数目相比，计算细胞接种效率PE。各照射处理组平均细胞存活分数（SF）实际为各组细胞克隆形成的平均数除以相应细胞接种数与接种效率的乘积。四、细胞存活曲线拟合、参数计算与曲线绘制方法SPSS软件数学拟合，给出模型中k和n估计值大致步骤如下：计算、整理不同辐射吸收剂量D照射下细胞相应组的细胞平均存活分数SF（校正接种效率后的平均存活分数，这是第一步），手填写成剂量D与存活分数SF的纸质二维表格；启动SPSS软件,定义变量名D和SF、字段宽度以及小数点后位数，将SF显示精度定为小数点后4位数，输入D和SF的原始数据建SPSS电子二维数据表；选择SPSS软件中非线性回归（Nonlinearregression）窗口，将SF设置为因变量（Dependent），数学公式表达模型中输入1-[1-EXP[-k*D]**n]，将模型参数k和n迭代的起始值分别设置为0.0001，将模型参数k和n数值各自限制在大于或等于0.0001以内，保存上述分析条件；迭代拟合的算法方式选择levenburg-Marquadt；执行SPSS运算并显示出所保留SPSS特有的结果存档文件。运算结果显示文件中有不同迭代过程剩余的残差平方和、根据1-[1-EXP[-k*D]**n]拟合后的k和n估计值、k和n参数估计值的相关性，以及ANOVA分析表，其中ANOVA分析表中给出的统计学显著性检验概率为拟合优度值，而直接给出的k和n估计值可用于下一步D0、Dq和D37参数的计算。计算单击多靶模型中D0、Dq和D37值，以及增敏比SER根据k和n参数值计算出D0、Dq和D37，其相互之间的关系式如下:利用EXCEL软件绘制细胞存活曲线绘制过程大致步骤如下：启动EXCEL软件，建立辐射剂量D和细胞存活分数SF的理论预测值数据的二维表格。其中，辐射剂量D栏直接填入不同剂量；细胞存活分数SF的理论预测值数据来源于EXCEL的直接计算，计算过程为：fx栏输入=1-POWER[(1-EXP(-k*D）**n]公式，其中k和n务必要换成来自SPSS模拟方程所获得的k和n参数估计值的具体数字,不能填其字母。回车运行运算后所获得各剂量组细胞存活分数的预测值，并自动填入相应SF栏内；启动EXCEL绘图XY散点标准模式，输入标题、纵横轴名称【如HeLa细胞伽玛照射后存活曲线单击多靶模型图、SF、Dose(Gy)】，去掉网格线、图背景阴影、图例和线框；点击Y轴坐标轴，选刻度项，修改最小刻度0.01，最大刻度10，主要刻度10，次要刻度10，数轴交叉于0.001，选对数刻度；点击各组各点，选数据系列格式，线型选自定义，线形平滑；图幅大小设置5X20。获得细胞存活曲线图之后，可手工在细胞存活曲线上不同辐照剂量位置添加相应实测的细胞存活分数，这样通过比较预测值与实测值之间的差异判断出细胞存活曲线拟合是否优良，也可以添加相应参数D0、Dq和D37等具体的位置。五、衣霉素对伽马射线细胞增殖性死亡的影响实验设计、分组与实验结果衣霉素（tunicamycin，Tun）是由放线菌（Streptomyceslysosuperficus）产生的一种核苷酸抗生素。在含天冬酰胺糖蛋白糖链生物合成过程中，衣霉素能抑制N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移到脂质载体上，从而影响内质网中一些糖蛋白的形成，成为诱导内质网应激的一种阳性试剂。肿瘤、心血管病、神经退行性改变等多种疾病发生发展过程均与内质网应激有关，但是细胞内质网应激本身是否能导致肿瘤细胞对电离辐射的抵抗目前尚未完全明确。甘氨双唑钠(CMNa，希美钠)是我国创制的一种硝基咪唑类化合物，在临床肿瘤放射治疗中它已经被广泛地作为放射增敏剂增强射线对肿瘤细胞的杀伤效果。甘氨双唑钠是通过使细胞缺氧达到降低受试细胞对电离辐射的抵抗，因此实验室研究中甘氨双唑钠通常被作为一种辐射增敏的阳性对照，即SER大于1。本次实习实验目的是了解经衣霉素处理过的人宫颈癌HeLa细胞在电离辐射伽马射线形成的细胞增殖性死亡能力方面是否具有辐射抵抗作用，并评价衣霉素相对于单纯照射组抵抗细胞增殖性死亡的能力大小。本实验分三组，每组设3个平行，即（1）单纯电离照射，CTR组；（2）1.25µg/mlTun预处理8h后加电离照射，Tun组；和（3）200µg/mlCMNa预处理30min后加电离照射，CMNa组。实验结果如下附表。附人宫颈癌HeLa各组细胞接种数、受照剂量、细胞存活克隆实测数接种数Dose(Gy)CTRTunCMNa60004143754054614384353963974086000.531437231936336129729632329160012913172873253542492673242371000224429518728432219527634122640004214338215253392178235327187800061233237517428287161278119100008672604793277387825257六、实习目标与思考题实习目标1、计算各组细胞受照剂量下，不同处理组实际平均细胞存活分数；2、利用SPSS软件根据单击多靶数学模型拟合剂量与存活分数之间的关系，进一步得到不同处理组细胞存活曲线中k、n估计值，据此再求出不同处理组相应D0、Dq和D37参数。注意各组实验细胞存活曲线拟合优度的检验；3、计算Tun和CMNa预处理后，各自与对照组相比的辐射增敏比SER。根据CMNa预处理组SER值判断本次细胞存活曲线实验是否成功（标准是SER大于1），再根据Tun预处理组SER值决定衣霉素是否具有抵抗电离辐射的作用；4、根据不同处理组细胞存活曲线中k、n估计值和单击多靶数学模型，利用EXCEL软件计算出各组细胞克隆存活分数预测值；根据存活分数预测值和照射剂量绘制细胞存活曲线，并描出各实测细胞克隆数以及相应D0、Dq和D37参数值数据点的位置。5、请用书面形式回答以下思考题。思考题1、本实验在证明衣霉素抵抗电离辐射能力的设计上尚存哪些不足，为什么？设计上要补充哪些实验内容可以支持你的观点，为什么？2、放射生物学中单击多靶数学模型与线性二次方数学模型推导过程各自所依据的主要理论是什么？本实验结果如果改用线性二次方数学模型进行结果处理，将会出现什么样新的实验结果与结论，为什么？3、什么叫电离辐射的亚致死性细胞损伤修复？请详细讨论亚致死性细胞损伤修复与细胞增殖性死亡之间的关系。七、参考文献[1]M.Verheij,H.Bartelink,Radiation-inducedapoptosis,CellTissueRes301(2000)133-142.[2]T.Sanli,C.Liu,A.Rashid,S.N.Hopmans,E.Tsiani,C.Schultz,T.Farrell,G.Singh,J.Wright,T.Tsakiridis,Lovastatinsensitizeslungcancercellstoionizingradiation:modulationofmolecularpathwaysofradioresistanceandtumorsuppression,JThoracOncol6(2011)439-450.[3]S.H.Kim,J.H.Kim,LethaleffectofadriamycinonthedivisioncycleofHeLacells,CancerRes32(1972)323-325.[4]M.Fitzek,K.R.Trott,ClonalheterogeneityindelayeddecreaseofplatingefficiencyofirradiatedHeLacells,RadiatEnvironBiophys32(1993)33-39.[5]S.Xia,Y.Zhao,S.Yu,M.