液液萃取法分离-环糊精反应体系中的品质联用

液液萃取法分离-环糊精反应体系中的品质联用

环糊精是通过环糊精葡萄糖转移酶（gst酶）的作用淀粉合成的环糊精。这些物质由六个或六个葡萄糖单位（-1）和4-糖苷组组成，最常用的是-、-和-环糊精，它们由6、7和8个葡萄糖单位组成。由于环糊精具有内腔疏水而外部亲水的独特分子结构,能容纳疏水性客体分子形成包合物,从而显著改善客体分子的理化性质如溶解性、稳定性等,因此,在食品、医药、化妆品等领域中具有广阔的应用前景。目前,工业上生产和使用的环糊精绝大部分是β-型。事实上,相比于β-环糊精,α-环糊精具有独特的性质和特有的用途,由于其空腔较小,更适于包合低分子量的客体小分子,能更好地用于分子识别、纳米材料等;其次由于水溶性较高,其对客体分子的增溶效果更加明显。α-环糊精的制备一般采用控制工艺,即在酶反应体系中加入适当的有机溶剂,使合成的α-环糊精与之形成不溶于水的复合物而沉淀,这种沉淀作用能减轻产物α-环糊精对反应的抑制,达到增加收率的目的。其中,最常用的复合剂为癸醇。然而,癸醇在使用过程中也存在一些不利的因素,如它的沸点高达229℃,很难从水溶液中去除。为了从制备α-环糊精的反应体系中分离和回收癸醇,通常采用水蒸气蒸馏法,即根据道尔顿分压定律,互不相溶的液体混合物的蒸汽压等于它们单独存在时的蒸汽压之和,当蒸汽压之和等于大气压时液体开始沸腾,混合物的沸点比其任一组分都低,所以该法可在不到100℃下利用水蒸气将癸醇从复合物中分离出来。但此法存在能耗过高、危险系数较大、费时、稀释反应母液等缺点,为实验室分析和实际生产操作带来诸多不便,因此,建立更有效的癸醇分离方法显得尤为重要。液液萃取是利用两种互不相溶互不反应的溶剂中溶解度或分配系数的不同,使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中,因其操作简便、能耗低、快速等优点,得到了广泛应用。本研究利用萃取原理建立了快速分离酶法制备α-环糊精反应体系中癸醇的新方法,从而取代分离癸醇的传统方法——水蒸气蒸馏法。1实验部分1.1-环糊精及其衍生物的合成Waters600高效液相色谱仪(美国Agilent公司),配示差折光检测器;HypersilNH2色谱柱(4.6mm×250mm,5μmAPS-2Hypersil微粒),美国Thermo公司)。α-环糊精标准样品(纯度99%,Sigma公司),使用前于105℃烘箱烘干3h;软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶,日本天野酶制品株式会社);乙腈(色谱纯,美国Tedia公司);苯、石油醚、无水乙醚、癸醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);实验用水为超纯水设备(美国Milli-Q公司)制备的超纯水。1.2-环糊精萃取条件优化称取7.50gα-环糊精标准样品于烧杯中,用纯水溶解,转移至250mL容量瓶中,并用纯水定容,配制成3%(w/v)α-环糊精溶液,用于癸醇萃取条件优化。分别准确称取0.25、0.50、1.00、1.50和2.00gα-环糊精于50mL容量瓶中,并用纯水定容,配制成0.5%、1%、2%、3%和4%(w/v)α-环糊精标准溶液,用于癸醇萃取方法的线性范围检测。1.3-环糊精-研发取20mL3%(w/v)α-环糊精溶液于50mL具塞三角瓶中,加入癸醇,轻轻摇匀,然后放入旋转摇床中,40℃下保温1h以形成α-环糊精-癸醇复合物。α-环糊精-癸醇复合物形成后,加入萃取剂,在20～40℃下,旋转摇床中萃取一定时间后,转移至分液漏斗中,静置30min,进行两相分离。收集下层水相中的α-环糊精溶液于离心管内,HPLC检测分析。1.4差折光分离器采用ThermoAPS-2HypersilNH2色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)和Waters示差折光检测器,测定条件如下:流动相为乙腈-水(61∶39,v/v);流速1.0mL/min;柱温30℃;进样量10μL。1.5数据的统计与分析所有试验均重复3次,采用EXCEL数据处理系统计算平均值和标准差。2结果与讨论2.1-环糊精-为酰氯苯磺酸钠的沉淀率测定在α-环糊精的工业化生产中,复合剂癸醇的添加量通常为基于反应液体积的5%～10%(v/v)。为了确定本研究中癸醇的添加量,参照1.3节的方法,在20mL3%(w/v)α-环糊精溶液中分别加入1%、2%、3%、5%和8%(v/v)的癸醇形成α-环糊精-癸醇复合物,离心,取上层清液,测定α-环糊精的沉淀率。如图1所示,α-环糊精的沉淀率随癸醇添加量的增加而逐渐增大,当癸醇的添加量为α-环糊精溶液体积的5%(v/v)时,沉淀率达95%;随着癸醇添加量的继续增大,α-环糊精的沉淀率并没有明显变化,故癸醇的添加量定为5%(v/v),即20mL3%(w/v)α-环糊精溶液中添加1mL的癸醇。2.2冰醋酸、乙醇、苯、石油醚、醚的萃取萃取剂的选择原则主要有:密度必须小于水且不溶于水;对目标萃取物癸醇的溶解能力大;较好的色谱行为,不影响α-环糊精的定性定量分析。癸醇,溶于冰醋酸、乙醇、苯、石油醚、乙醚等,其中冰醋酸、乙醇与水互溶,萃取后不易分离。参照1.3节的复合物形成方法,在3%(w/v)α-环糊精溶液中加入一定量的苯、石油醚或乙醚,结果发现,苯、石油醚与α-环糊精易形成复合物而沉淀,因此,苯、石油醚不适合作为癸醇的萃取剂;而加入乙醚的α-环糊精溶液中未见沉淀,HPLC检测后发现,水相中α-环糊精的浓度基本上没有改变,说明乙醚与α-环糊精并不形成复合物,故选择乙醚作为萃取剂。2.3分离剂的用量在20mL3%(w/v)α-环糊精溶液中添加1mL癸醇形成α-环糊精-癸醇复合物后,分别加入5、10、15和20倍于癸醇体积的乙醚,30℃下萃取一定时间,测定α-环糊精的溶解率,从而了解癸醇的萃取情况。因为环糊精溶解率越高,说明更多的癸醇从α-环糊精-癸醇复合物中分离出来,环糊精则重新溶入水相中。结果如图2所示,α-环糊精的溶解率随着乙醚用量的增大而增大,当乙醚与癸醇体积比为15∶1和20∶1时,α-环糊精的溶解率相当,分别为94.12%和95.31%,说明乙醚与癸醇体积比大于15时,癸醇即可与α-环糊精发生分离,溶于乙醚,所以萃取剂乙醚的用量确定为癸醇体积的15倍。此外,萃取起始阶段,随着萃取时间的延长,α-环糊精溶解率逐渐增加。当萃取时间达到30min时,继续延长时间,溶解率并无明显增加,说明30min的萃取时间足以使体系中的癸醇转移到萃取相乙醚中达到萃取平衡,故萃取时间选择30min。2.4萃取物和萃取剂易挥发温度是影响萃取效率的重要参数,升高温度不仅可加快目标萃取物的扩散速度还可增加目标萃取物在萃取剂中的溶解度;但温度过高,目标萃取物和萃取剂易挥发。由图3可知,萃取温度越高,乙醚萃取癸醇的速率越快。当萃取温度为20℃时,萃取60min后α-环糊精的溶解率才能达到90%以上;30℃时,萃取30min后α-环糊精的溶解率能达到95%左右;而40℃下α-环糊精溶解率达到95%需要20min。因乙醚易挥发,40℃高于乙醚的沸点(34.5℃),所以选择30℃为萃取温度。2.5将-环糊精分离为了确定萃取法分离癸醇所适用的α-环糊精浓度范围,分别取0.5%、1%、2%、3%、4%和5%(w/v)α-环糊精标准溶液于50mL具塞三角瓶中,加入5%(v/v)癸醇,参照1.3节方法形成α-环糊精-癸醇复合物后,再加入15倍于癸醇体积的乙醚,30℃下萃取30min,测定水相中的α-环糊精,结果如图4。由图4可知,在优化条件下,α-环糊精的色谱峰面积在0～4%(w/v)的浓度范围内与浓度呈现良好的线性关系,线性回归方程为Y=0.9467X,相关系数为0.9919,说明在该浓度范围内,萃取法能较彻底地将癸醇从体系中分离出来。而当α-环糊精浓度超过4%时,线性关系不显著,说明体系中部分α-环糊精仍以沉淀形式存在,一次萃取不能彻底将癸醇从体系中分离出来。其原因可能是,α-环糊精的浓度太高时,其对癸醇的复合作用更强,乙醚不容易将癸醇完全萃取出来。在这种情况下,可采用多次萃取的分离方法。2.6--环糊精-3-甲基苯磺酸酯的制备按照α-环糊精工业化生产所采用的控制工艺,以50mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)配制的15%(w/v)麦芽糊精(DE3)为底物,5%(v/v)的癸醇为复合剂,CGT酶用量为10U/g(底物),40℃、200r/min摇床中反应6h取样,灭酶。采用水蒸气蒸馏法和液液萃取法分别对反应体系中的癸醇进行分离,测定α-、β-和γ-环糊精收率和总收率,结果如表1所示。采用萃取法分离所测得的α-、β-、γ-环糊精收率和总收率与采用水蒸气蒸馏法相当,说明液液萃取法能够有效分离酶法反应中的癸醇。3萃取剂的选择