白木香内生真菌菌株boryosphaeiarhodinaa13接种后化学成分的gc-ms分析

白木香内生真菌菌株boryosphaeiarhodinaa13接种后化学成分的gc-ms分析

白桂花（aquilaris）gilg，又名土香，属于瑞香科的香蒲植物，是中国特有的热带和亚热带树种。这是中国生产沉淀的唯一植物资源。当白木香树干受到损伤或刺激时会分泌一种黑色树脂,即为沉香树脂。沉香是一种名贵中药,其药用始载于《名医别录》,列为上品。其味辛、苦,性微温,具行气止痛、温中止呕、纳气平喘功效,用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症。此外,它还是一种在亚洲广受欢迎和广泛应用的传统名贵天然香料。沉香的化学成分主要包括倍半萜类和2-(2-苯乙基)色酮类,按结构类型来分,倍半萜类有沉香呋喃类、杜松烷类、桉烷类、大根香叶烷类等。目前,白木香形成沉香的机理和过程并不清楚。不少研究显示,沉香属植物结香与真菌相关。自20世纪30年代,从沉香属植物结香部位分离到的真菌有葡萄座腔菌(Botryosphaeriarhodina)、色二孢菌(Diplodiasp.)、镰刀菌(Fusariumsp.)、曲霉(Aspergillussp.)、毛霉(Mucorsp.)、青霉(Penicilliumsp.)、木霉(Trichodermasp.)、裂褶菌(Schizophyllumsp.)等。在本课题组的前期研究中,从白木香不同部位分离到20多株真菌。人工造香实验发现葡萄座腔菌菌株B.rhodinaA13侵染的促香效果显著。与空白对照相比,它能使白木香快速产生黄褐色沉香树脂。在此基础上,我们又对不同来源的白木香结香部位真菌类群进行研究,发现葡萄座腔菌是结香部位的优势真菌。我们的研究结果和冯乃宪的基本一致,他从沉香木块中分离到9株真菌,通过菌种对沉香组成成分苄基丙酮的耐受性实验、菌种接种后人工结香木材宽度、燃烧香味比较,发现葡萄座腔菌有促进结香作用。他还对其促进结香后精油成分进行了GC-MS分析,发现含有沉香倍半萜类沉香螺旋醇以及萘酮类、酚类等沉香形成前体成分。此外,魏建和的研究结果也证实葡萄座腔菌是一种产沉香的诱导剂。为了研究真菌对白木香形成沉香的作用机理,研究人员采用了野外植株接种实验和悬浮细胞培养方法。野外植株接种实验能反映白木香结香的真实情况,但实验周期长,且容易受环境中土壤、害虫、气候等诸多因素影响。悬浮细胞培养方法条件可控,方法简单,但存在的主要问题是与植株实验有差异,如研究表明在植株水平上可以在病原菌侵染部分形成局部高浓度活性氧而起一定作用,但在悬浮细胞系统中就不能形成这种局部效应。为此,本研究参照植物病理学文献,首次建立了一种离体白木香枝条实验模型,为研究真菌诱导白木香形成沉香的作用机理奠定基础。1材料和机器1.1白还原树叶片生长特性内生真菌BotryosphaeriarhodinaA13分离自白木香结香部位,保藏在广东省微生物菌种保藏中心;新鲜白木香树枝采自中国林业科学研究院热带林业研究所实验基地;沉香醇浸膏由广东省信宜市珍稀沉香发展有限公司提供。1.2覆压电液RE-2000型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(II)型循环水式真空泵,巩义市英峪予华仪器厂;DLSB-5/10低温冷却液循环泵,郑州长城科工贸有限公司;FA2004电子分析天平,上海天平仪器厂;超净工作台,上海恒益科技有限公司;LRH-250-G光照培养箱,广东省医疗器械厂;ThermoTraceDSQ型色谱-质谱联用仪,美国ThermoFinnigan公司。2实验方法2.1白象兴枝移植试验2.1.1细菌激活保藏于低温冰箱中的菌株B.rhodinaA13挑取少量菌丝体接种到经高压灭菌的PDA斜面上,28℃培养7d进行菌种活化。2.1.2白木耳枝条的制备将粗约0.5~1cm的新鲜白木香枝条切成约8cm左右的小段,先在0.1%升汞溶液中浸泡3~7min,取出后用无菌水漂洗3~4次,再放入75%乙醇中浸泡3~7min,无菌水漂洗3~4次,然后用灭过菌的打孔器在白木香枝条上打孔。2.1.3hodinaa13斜面菌种的制备将打孔后白木香枝条放入有湿润无菌滤纸的培养皿上。用5mL无菌水冲洗真菌B.rhodinaA13斜面菌种,用大头吸管吸取菌液,注入到打孔的白木香枝条上。接种后培养皿用保鲜膜封口,在黑暗、27℃环境中放置20d。同时设置未接菌的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养7d的菌株A13菌丝对照组,每个实验组设置3个平行。2.2样品前处理及gc-ms分析2.2.1微生物滤膜将各实验组样品放入三角瓶中,加入95%乙醇浸泡过夜,提取液旋转蒸发仪蒸发至干,用1.5mL氯仿溶解后过0.22μm微孔滤膜,待用。设置沉香对照组,将沉香醇浸膏用氯仿溶解并过微孔滤膜后备用。2.2.2初始温度条件气相色谱条件:Agilent毛细管色谱柱DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm);色谱柱程序升温条件:初始柱温60℃(保持2min),以5℃/min升至150℃,再以1℃/min升至160℃(保持15min),再以8℃/min升至250℃(保持20min);传输线温度250℃,载气为高纯氦气,流速1.0mL/min;进样量1μL,程序升温汽化不分流进样,初始温度60℃,14.5℃/min升温至250℃。质谱条件:电子轰击(EI)离子源,离子源温度230℃;扫描质量范围(m/z)40~500。各实验组组分采用NIST2002质谱数据库检索进行定性,采用色谱峰面积归一法进行相对定量。3结果3.1白色抗菌、组织在接种后2~4d,离体白木香树枝打孔处长出白色菌丝体。随着培养时间的延长,在9~12天,菌丝布满整条树枝以及平皿上的滤纸,颜色由白色变成黑色(图1)。3.2化学成分分析(菌株A13+树枝)实验组的提取物采用GC-MS鉴定出11个化合物,其化学成分主要是吡喃酮、脂肪酸、烷醇和萜类,其中萜类化合物包括2,6-二甲基,1,7-辛二烯-3-醇、异叶绿醇、叶绿醇、3,7,11-三甲基,1-月桂醇和5,9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇。沉香对照组提取物中鉴定出24个化合物,其化学成分主要是萜类、脂肪酸和烷醇类,其中萜类化合物包括反-松香芹醇、双环大根香叶烯、香橙烯、绿花白千层醇、5,9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇。树枝对照组提取物中鉴定出8个化合物,主要是脂肪酸和烷醇类。菌株A13对照组提取物鉴定出9个化合物,主要是炔类、脂肪酸和烷醇类(表1,图2)4分离的菌株a3研究结果显示,未接菌的离体白木香树枝对照组和PDA培养7d的菌株B.rhodinaA13对照组提取物中未检出萜类化合物,而接种A13菌株的离体白木香树枝实验组和沉香对照组中都有萜类化合物,包括大根香叶烷类倍半萜5,9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇。这说明菌株A13能诱导离体白木香枝条形成沉香倍半萜类化