中药守宫多糖体外抗肿瘤免疫的研究进展

中药守宫多糖体外抗肿瘤免疫的研究进展

保护宫殿是虎科动物无角刺科动物的特征。它可以去除器官疾病的所有。这是一种传统的冷、热、硬、中药，具有驱风、定痛、益气、解毒的功效。长久以来,守宫被用于治疗瘰疬癌肿,是一味重要的抗癌动物药。国内诸多医家使用守宫治疗恶性肿瘤取得了很好的疗效。研究表明:鲜壁虎冻干粉可以抑制H22小鼠肿瘤生长,诱导肿瘤细胞凋亡及血管生成。传统中医认为守宫咸寒有小毒。药学研究发现守宫含有马蜂毒相似的有毒物质及组织胺类物质、脂肪油、多种氨基酸、微量元素、维生素等。但这些成分的发现不足以系统阐明守宫的抗肿瘤机制及具体作用靶点,而守宫的毒性作用又限制了其临床大剂量应用,故守宫的日用量一般仅1.5～4.5g。国内外至今未能从守宫里分离出其抗肿瘤、抗病毒与免疫调节的有效成分。大量研究表明多糖物质对正常的人体细胞无毒。经过前期大量研究,笔者从守宫中分离得到硫酸守宫多糖,发现该成分可以抑制肝癌细胞BEL-7402的增殖并诱导分化,而对正常肝细胞L-02的生长发育几乎没有影响,起到了很好的增效减毒作用。本实验进一步研究守宫多糖体外对淋巴细胞增殖及细胞毒作用的影响,为探讨守宫抗肿瘤作用物质基础提供依据。大量研究表明,多糖具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。多糖可以活化巨噬细胞,促进淋巴细胞有丝分裂,增强NK细胞与LAK细胞活性,增强TD细胞功能,诱生IL-2、IL-12、TNF等细胞因子。目前国内外从天然原料药里分离得到的绝大多数为植物多糖和微生物多糖。笔者从中药守宫中分离得到守宫多糖(geckopolysaccharide),本研究将进一步探讨守宫多糖体外淋巴细胞抗肿瘤免疫的影响。1pbmc的诱导、增殖和活化1.1主要试剂与药品:守宫多糖(质量分数>95%)由天津市肿瘤医院中西医结合科副主任医师吴雄志博士提供(其分离制备工艺已申请国家专利,专利号:CN1676533A)。肝癌BEL-7402细胞由天津市肿瘤医院中心实验室提供。RPMI-1640培养液购自北京天润普达生物科技有限责任公司。PBS磷酸盐缓冲液购自北京中山金桥生物技术有限公司。CO2恒温培养箱(ThermoHEPAclass100)。1.2肝癌细胞冻融液的制备:以肝癌BEL-7402细胞冻融液为肿瘤抗原。取BEL-7402细胞2×106/mL(以PBS液调整细胞数),经-70℃(30min)、37℃(5～10min)反复冻融3次,镜检无细胞,冻融液培养无细胞生长,即得BEL-7402肿瘤相关抗原,保存于-20℃备用。1.3密度梯度法分离外周血单核细胞(PBMC):抽取健康人外周血20mL,立即注入经肝素抗凝试管,加PBS20mL稀释,缓慢加入到有淋巴细胞分离液40mL的离心管中,2000r/min离心20min,轻轻吸出中间白色层细胞,PBS洗涤2次,即为较纯的PBMC。PBMC于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养,培养基为含10%灭活小牛血清的RPMI-1640(Gibco公司),含1%双抗(青霉素和链霉素)。1.4淋巴细胞增殖试验:将PBMC以2×106/mL密度分6组(每组6孔)接种于96孔板中。前3组在接种3h后,分别加入守宫多糖100、10μg/mL与等体积PBS。后3组在接种后3h吸取未贴壁细胞,移入另外18个空白孔中,然后每组分别加入守宫多糖100、10μg/mL与等体积PBS。细胞共培养4d,培养结束前4h将前3组每孔轻轻吸出100μL培养液后,吸取未贴壁细胞及上清,移入另外18个空白孔中。后3组每孔轻轻吸出100μL培养液后,所有6组细胞每组分别加入MTT(5mg/mL)10μL,放入培养箱中继续培养4h后,1200r/min离心10min,去上清,加入DMSO100μL,用酶标仪测490nm处吸光度(A)值表示淋巴细胞增殖水平。1.5PBMC的活化:用RPMI-1640完全培养基调整PBMC为2×106/mL,加入6孔板中培养,6h后分别加守宫多糖与肝癌细胞冻融液:①只加肝癌细胞冻融液(终浓度为1×104/mL);②加肝癌细胞冻融液与守宫多糖100μg/mL;③加肝癌细胞冻融液与守宫多糖10μg/mL。各组加入肝癌细胞冻融液的肝癌细胞终浓度为1×105/mL。1.6BEL-7402细胞培养:将BEL-7402细胞以1.5×104/mL密度接种于96孔板中,于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养,培养基为含10%灭活小牛血清的RPMI-1640,含1%双抗(青霉素和链霉素)。当细胞进入对数生长期时用作淋巴细胞试验的靶细胞。1.7淋巴细胞毒试验:将PBMC与肝癌细胞冻融液共培养3d后,吸取未贴壁细胞,离心后分别计数PBMC数量,取对数生长期的BEL-7402作为靶细胞,各组均按2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1和40∶1的效靶比进行杀伤实验(每个浓度均设5个复孔),培养48h,培养结束前6h每孔轻轻吸出100μL培养液,加入MTT(5mg/mL)10μL,放入培养箱中继续培养6h后,加入0.01mol/LHCl-10%SDS100μL,3h后用酶标仪于490nm处测A值表示存活的肝癌细胞数量。1.8统计方法:全部数据以x¯±sx¯±s表示。统计方法采用双因素方差分析,全部统计由统计软件包SPSS11.0完成。2结果2.1守宫多糖的丝分裂模型守宫多糖可促进淋巴细胞的增殖(P<0.001),提示守宫多糖具有有丝分裂原样作用。贴壁细胞也可促进淋巴细胞的增殖(P=0.007),并可增强小剂量守宫多糖的促淋巴细胞有丝分裂作用,结果见表1和表2。2.2细胞对肺癌细胞的杀毒作用守宫多糖可增强肝癌抗原活化的淋巴细胞的细胞毒作用,促进淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用(P<0.001,R2=0.240)。不同靶效比之间,淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用无显著差异(P=0.007),结果见表3和表4。3守宫多糖对肺癌细胞的作用PBMC中的贴壁细胞主要是单核细胞与树突状细胞,两者均为外抗原呈递细胞(APC)。守宫多糖可促进淋巴细胞的增殖,提示守宫多糖具有丝分裂原样作用。APC可促进淋巴细胞的增殖,并可增强小剂量守宫多糖的促淋巴细胞有丝分裂作用。守宫多糖可增强肝癌抗原活化的淋巴细胞的细胞毒作用,促进淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用。需要指出的是,许多中药都具有双向调节的作用。不同剂量的多糖对体液免疫与细胞免疫的影响是不同的。本实验结果表明守宫多糖小剂量时活化体液免疫而大剂量时活化细胞免疫。体内T淋巴细胞的活化需要APC的呈递抗原,形成MHC-Ag-TCR三元体,并在APC分泌的细胞因子的作用下活化增