曲霉发酵过程中木聚糖酶的提取与鉴定

曲霉发酵过程中木聚糖酶的提取与鉴定

近年来，国际原油价格和食品价格迅速上涨。在能源危机和粮食危机的双重压力下，世界各国都重新考虑可取代石油生产源的开发。其中木聚糖作为植物半纤维素的重要组分,是自然界中除纤维素以外含量最丰富的可再生生物资源,它的降解离不开木聚糖酶的作用。木聚糖酶(xylanase)是指专一降解木聚糖的一组酶的总称,除了β-1,4-D-内切木聚糖酶、β-1,4-D-外切木聚糖酶和β-木糖苷酶之外,还包括如α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酶和酚酸酯酶等酶。木聚糖酶在饲料、食品、造纸、纺织和能源等工业中都显示出广阔的应用前景,其中作为饲料添加剂应用于饲料行业和作为漂白剂应用于制浆造纸工业的研究异常活跃。笔者主要报道一株已用于工业化固态发酵生产木聚糖酶的高产菌株所产木聚糖酶的纯化方法以及性质的研究结果,以期为进一步克隆木聚糖酶基因和构建基因工程菌提供重要的生物信息。1材料和方法1.1材料表面1.1.1保藏、发酵菌种为宇佐美曲霉(Aspergillususamii),由江南大学医学系分子生物学研究室保藏。固态发酵培养基:250ml三角瓶内装麸皮3.4g、玉米芯4.6g、1%NH4NO3、0.3%KH2PO4、0.1%CaCl2、0.1%MgSO4,固体料水比为1∶1.2,自然pH;28℃静置培养64~72h,其间翻曲2~3次。1.1.2ds-东南角、高速冷冻离子质量、垂直电泳系统及材料特性桦木木聚糖为Sigma产品;PhenylSepharose、DEAESepharose为Pharmacia产品;SDS标准蛋白购于上海思吉公司;SephadexG-75、SDS购于上海华美公司(进口分装)。高速冷冻离心机由ThermoIEC公司生产;垂直电泳系统(Mini-PROTEANII)由Bio-Rad公司生产;常压层析系统:各种玻璃层析柱、蠕动泵、核酸蛋白检测仪、电脑采集器、电脑记录仪、打印机和分步收集器等,由南京南达生物技术开发公司生产。1.2分析1.2.1木聚糖酶活性测定DNS法测定酶活性。酶活性单位定义为:每分钟产生相当于1μmol还原糖(以木糖计)的酶量为1个酶活性单位(IU)。1.2.2测定蛋白质浓度参照Lowry等方法进行,以牛血清白蛋白为标准蛋白。1.2.3紫外吸收光谱的测定用紫外/可见光分光光度计测定样品在200~350nm波长间的紫外光吸收曲线及A280值。1.2.4凝胶-脱色-脱色用进口Ampholine(pH3.5~10.0)为两性电解质载体,胶浓度为5.4%,聚焦2h后将部分胶分割下来,分为12等份,捣碎,用1ml三蒸水浸泡,测浸提液的pH值,并绘制pH-距离图,剩下的凝胶进行固定-脱色-染色-脱色步骤,观察蛋白质区带,在标准曲线上查出等电点。1.2.5氨基酸的测定将纯化酶2.5ml置于安锫瓶中,加入2.5ml6mol/L浓盐酸,抽真空封口,110℃烘箱中水解24h,打开封口后定容至10ml,过滤后取1ml真空赶酸,再加5ml0.02mol/LHCl,用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定水解液中各种氨基酸的含量。1.3酶属性的测定1.3.1温度稳定性测定应的酶活性在pH4.6、反应15min条件下,分别测定在不同温度下酶促反应的酶活性。将某一温度下的最高酶活性定为100%,作温度-相对酶活性曲线。在50℃、反应15min条件下,分别测定在不同pH值时的酶活性。将某一pH值时的最高酶活性定为100%,作pH-相对酶活性曲线。1.3.2残留酶活性测定将酶液在不同温度下处理一定时间,立即冷却。按常规法(底物浓度5mg/ml、pH4.6和50℃反应15min)测定残留酶活性。以未处理的酶活性为100%,作温度-相对残留酶活性曲线。将酶液置于不同pH值的缓冲液(pH3~7为柠檬酸-Na2HPO4系列缓冲液,pH8~9为Tris-HCl系列缓冲液)中,并于40℃处理1h,测定残留酶活性并作酶的pH稳定性曲线。1.3.3金属离子对酶活性的影响将各种金属离子溶液(25mmol/L)与酶液等体积混合,于40℃处理1h。按常规法测定酶活性,以不加金属离子的酶活性为100%。1.3.4纯酶蛋白亚基分子质量和完整酶分子质量分别用SDS和G-75凝胶过滤2个不同的分离体系进行测定。前者测定的是纯酶蛋白亚基的分子质量,后者为完整酶的分子质量。SephadexG-75凝胶过滤在ϕ1.6×100cm柱上进行,洗脱液为pH6.8、20mmol/L磷酸盐缓冲液,流速为0.25ml/min。1.3.5聚糖酶活性测定用pH4.6的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制不同底物浓度的桦木木聚糖溶液,其他条件相同情况下测定酶活性,利用Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出该酶的Km及Vmax值。2结果与分析2.1酶纯度研究2.1.1温和的方法2.1.1.饱和的确定向粗酶液中边加入固体硫酸铵边搅拌至65%的饱和度,置于4℃冰箱中过夜。于4℃、8000r/min离心15min,收集沉淀,4℃保存备用。2.1.1.粗酶液的提取用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解部分沉淀,加入一定量的硫酸铵,再于8000r/min离心10min,最终得到粗酶液15ml,加入到用起始缓冲液平衡好的疏水柱中,同一缓冲液洗脱一段时间后换低盐浓度的缓冲液洗脱(流速0.6ml/min)和收集(1管/10min,6ml/管),DNS法测定酶活,收集具有酶活性的酶液。2.1.1.样品的制备将收集的酶液用硫酸铵按70%饱和度沉淀酶蛋白,8000r/min于3℃离心15min,将沉淀用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解至2ml,加入到用0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡好的G-75分子筛柱中,同一缓冲液洗脱(流速0.4ml/min),收集(1管/10min,4ml/管)检测,合并具有较高酶活性的洗脱液。2.1.1.pcr反应物和洗脱溶液将收集的酶液用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析24h,浓缩后上柱DEAE阴离子交换柱,用含0~0.2mol/LNaCl的pH6.8、20mmol/L磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱(流速0.4ml/min)和分部收集(1管/5min,2ml/管),合并具有较高酶活性的洗脱液。合并液用SephadexG-25脱盐、聚乙二醇浓缩,用于酶学性质测定。2.1.2不同纯化方法对木聚糖酶回收率的影响由表1可见,最终木聚糖酶的纯化倍数为22.6,回收率为6.7%,较之前的方法有较大进步,与其他文献木聚糖酶的纯化结果相比,纯化倍数较高而回收率较低。2.2酶的性质2.2.1高温对木聚糖酶活性的影响不同温度测定的最高酶活性出现在50℃;在35~50℃范围内,酶活性随温度的升高而逐渐增大,但超过50℃以后,酶活性迅速下降(图1),说明高温下该木聚糖酶易失活。不同pH值的酶活性测定结果见图2,对测定结果进行二次曲线拟合,显示最适作用pH值为4.6。2.2.2残留酶活性测定图3显示纯酶在45℃以下较稳定。例如在45℃处理60min,残留酶活性在85%以上;而在55℃和60℃处理10min,酶活性降至30%左右。图4显示纯酶对pH的变化不敏感,在pH5.0~9.0范围内稳定。2.2.3残余酶活性测定将下列金属离子与酶液混合,40℃保温1h,使终浓度为1mmol/L,按常规法测定残余酶活性,以不加金属离子的酶活性为100%。测定结果(表2)显示,Ca2+对其有促进作用,Mn2+、Pb2+、Sn2+有较强的抑制作用,其他离子也存在不同程度的抑制作用。2.3酶的物理和化学性质2.3.1相对迁移率的计算将纯酶的SDS相对迁移率代入标准蛋白分子的质量对数LogM与相对迁移率Rf的回归方程,求得其亚基的分子质量约为26.8kDa(图5);通过LogM-Time作图由凝胶过滤测得完整酶的相对分子质量约为25.0kDa。两种测定结果相近,说明该木聚糖酶为单亚基酶。2.3.2芳香族氨基酸的紫外吸收蛋白质在紫外区的吸收光谱,特别是210~230nm区肽键的紫外吸收和260~280nm区芳香族氨基酸的紫外吸收,可为蛋白质研究提供重要的资料。结果发现,该酶在波长250和280nm处分别有最小和最大吸收峰,是典型的蛋白质特征吸收峰;在200~230nm范围内有一个很大的吸收峰,它是由肽键的紫外吸收产生的。2.3.3等电点实验结果显示,纯酶蛋白区带距正极11mm,由pH梯度曲线求得等电点为pI4.2,证明了酶为酸性蛋白质,靠近正极从而带更多负电荷。2.3.4基于残基的酶蛋白结构和功能蛋白质?氨?基?酸组成的定量测定表明了该酶的氨基酸组成(表3),每种有多少残基,这些数据可为酶蛋白结构和功能的研究提供重要依据。测定结果表明,酶所含的酸性氨基酸Asp和Glu的含量(21.3%)较多,而所含碱性氨基酸Lys、Arg和His的含量(13.95%)较少,这与等电聚焦所测等电点的结果相符。2.3.5平均糖代谢的计算以一系列不同浓度的桦木木聚糖溶液为底物测定反应初速度,根据Lineweaver-burk双倒数作图法得到该酶的米氏方程为1/v=0.0129(1/[S])+0.0014。由此求得此酶的Km为9.2mg/ml,最大反应速度为1347μmol/(min·mg)。文献报道过的各种木聚糖酶的Km值范围为0.1~10mg/ml,表明该酶与底物的亲和力居中。3酸酶的氨基酸组分和酶学性质通过所采用的一系列方法对发酵液进行了纯化,并对纯酶做了比