木霉菌株对几种病原菌的抑菌效果

木霉菌株对几种病原菌的抑菌效果

木霉属丝菌和轻胞菌，具有无性繁殖于大自然的真菌性。其有性阶段是真菌、囊肿菌、囊肿菌、粪便壳和肉胃菌科的肉胃菌科，广泛分布于自然界，如土壤、植物残留物、植物根、叶缘等环境。拮抗木霉的种类主要有哈茨木霉(T.harzinum)、绿色木霉(T.viride)、钩状木霉(T.hamatum)、长枝木霉(T.longibrachiatum)和康氏木霉(T.koningii)5种。采用木霉菌来拮抗植物病原菌,可有效地保护植物表面有益的微生物菌群,提高对病原菌的抑制效果,解决化学农药的残留问题。近年,利用木霉菌防治不同类型的植物病原真菌病害得到更广泛的应用[4~6],木霉菌在生物防治领域有广阔的开发前景[7~11]。以土壤中分离的33株木霉菌株(Trichoderma)和棉花立枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum(Schl).f.sp.cucumerinumOwen)和马铃薯枯萎病菌(FusariumoxysporumSchlecht)3种病原菌作为研究材料,通过生长速率筛选和平板对峙筛选两步复合筛选体系,研究供试木霉菌株对病原菌的抑制作用,以期筛选具有高效抑菌效果的木霉菌株,为木霉菌的生防应用奠定坚实的基础。1材料和方法1.1山马铃薯枯病:f.sp.cu-sp.cu.3种供试病原菌,棉花立枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)、马铃薯枯萎病菌(FusariumoxysporumSchlecht)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum(Schl).f.sp.cucumerinumOwen),由山西农业大学植物病理实验室提供。1.2悬浮液的稀释和技术鉴定采用稀释平板法。采集的土样自然晾干、碾碎,用160目土壤筛过筛。取10g土样放入90mL无菌水的烧瓶,用涡旋仪充分振荡,吸取1mL悬浮液于9mL无菌水中稀释,从稀释后的悬浮液中吸取1mL在9mL无菌水中稀释,如此类推,稀释至体积分数为10-3、10-4、10-5。用微量移液枪从不同浓度土壤悬浮液中吸取0.1mL的悬浮液分散滴于马丁氏-孟加拉红平板上,用灭菌涂布棒涂匀,静置20min,在26℃的恒温培养箱中倒置培养,菌落形成后纯化。将纯化好的菌株接种到PDA平板上培养,将分离出的菌株在4℃下低温保存备用。1.3形态特征观察分离纯化好的菌株接种在PDA培养基上,于26℃下培养10d左右,把从菌落上挑取的菌丝及孢子制片,置于光学显微镜下,观察菌株的个体形态特点,包括菌丝、分生孢子梗和孢子形态,结合培养性状(菌落大小、颜色、形态、质地),从形态学上对菌株进行属的鉴定。1.4培养条件模型将分离鉴定得到的33株木霉菌株,转接在PDA平板上,放入培养箱中26℃恒温培养。分别在3、5、7d时测量菌落直径,记录分生孢子产生的时间,观察木霉菌的培养性状,从中筛选生长快、产生分生孢子早的木霉菌株。1.5高效抑菌试验将1.4筛选得到的木霉菌株进行平板对峙筛选。木霉菌株与培养7d的供试病原菌菌碟(0.6cm)成直线接在PDA平板两侧,两菌碟相距5cm,只接种病原菌不接木霉的平板做对照。设3次重复,倒置放入26℃的培养箱培养,分别在3、5、7d测量病原菌菌落和木霉菌落的直径,对照病原菌的菌落直径,记录菌落生长状况,计算抑菌率。抑制率的计算公式如下:抑制率/%=[(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/(对照病原菌菌落直径-0.6)]×100%2结果与分析2.1土壤中的木霉分离经过形态学鉴定,从土壤中分离得到的真菌菌株,共有33株属于木霉属(Trichoderma)真菌。2.2生长、产孢时间3d的木霉菌株,据木霉菌株的生长速度和产孢速度,将33株木霉菌株分为4大类,第一类是生长快(菌落直径>2.5cm)、产孢早(产孢时间≤3d)的木霉菌株,13株;第二类是生长快、产孢慢(产孢时间>3d)的木霉菌株,14株;第三类是生长慢(菌落直径≤2.5cm)、产孢快的木霉菌株,1株;第四类是生长慢、不产孢的木霉菌株,5株。表1列出了部分木霉菌株的培养性状。2.3木菌病与病原体的混合比较2.3.1棉生物测定对棉花立枯病菌的抑制作用从表2可见,13株木霉菌株对棉花立枯病菌均有不同程度的抑制作用,其中木霉菌株198-2b-2(图1-a)和198-4a-1对棉花立枯病菌的抑制作用最强,7d时的生长抑制率均为62.2%。木霉菌株198-5a-1将病原菌菌落边缘覆盖(图1-b),木霉菌株198-2b-2、198-4a-1、198-5a-1、198-5b-1、238-3-2和238-6-1(图1-c)等与病原菌接触部分均有黄色色素产生。2.3.2不同菌株对黄瓜枯病菌生长和抑菌带的影响从表3可见,13株木霉菌株对黄瓜枯萎病菌具有不同程度的抑制作用,其中木霉菌株198-2b-2(图2-a)和198-4a-1对病原菌的抑制作用最强,7d时对黄瓜枯萎病菌生长抑制率分别达到62.5%和60.9%。木霉菌株198-5a-1(图2-b)与病原菌接触部分有3mm左右的抑菌带产生。木霉菌株198-2b-2与病原菌接触部分有黄色色素产生,木霉菌株198-4a-1、198-4a-2、198-5a-3与病原菌接触部分有红色色素产生,木霉菌株238-3-2(图2-c)和238-4-1的菌丝长在病原菌的菌落上,导致病原菌的菌落颜色发黄,塌陷和菌丝消解。2.3.3病原菌生长和生长抑制率从表4可见,13株木霉菌株对马铃薯枯萎病菌的抑制作用不同,木霉菌株198-2b-2(图3-a)和198-4a-1对病原菌的抑制作用最强,7d时对病原菌生长抑制率分别达67.6%和66.2%,木霉菌株198-2b-2和198-5a-1与病原菌接触部分有黄色色素产生,木霉菌株198-4a-1(图3-b)将病原菌菌落覆盖,并在其上产生绿色孢子,木霉菌株198-5a-1(图3-c)、238-4-4和238-6-4与病原菌菌落间有一条明显的抑菌带。3高效木霉菌株的筛选和鉴定木霉菌是一类环境中普遍存在的重要微生物种群,该种群在土壤中有较强的生命力。对分离到33株木霉菌株进行生长速率筛选,得到13株生长速度较快、产孢早的木霉菌株与病原菌在营养竞争和空间竞争上更具优势。将13株木霉菌株与3种病原菌进行平板对峙筛选,得到2株抑菌效果较好的木霉菌株。木霉菌株198-2b-2对3种病原菌的抑菌率分别达62.2%、62.5%和67.6%;木霉菌株198-4a-1对3种病原菌的抑菌率分别达62.2%、60.9%和66.2%,是具有高效生防潜力的木霉菌株,可用于木霉生防效果的进一步研究。实验所用的木霉菌株,只进行了木霉属的鉴定,在筛选出高效生防潜力的木霉菌株后,应进行木霉菌株的形态学鉴定和分子鉴定,进一步确定生防木霉菌的分类。实验发现,木霉菌株与3种病原菌的平板对峙过程中出现一些特殊现象,如:木霉菌株198-5b-1和198-5a-1生长势很强,直接覆盖马铃薯枯萎病菌的