木霉素的气相色谱法测定

木霉素的气相色谱法测定

木霉素可抑制真核生物细胞（如人类宫颈传代细胞和兔子红血球细胞）中核糖体中的c-c形成，是蛋白质合成抑制剂。国外在20世纪70年代就开始关注木霉素在医学方面的应用,国内对木霉素的研究主要集中在对植物真菌病害的生物防治。项目组从浙江临安天目山采集的枸骨中分离筛选到一株活性内生真菌,经中国科学院微生物研究所鉴定为哈茨木霉菌。对该内生真菌发酵液活性物质的分离、提纯和结构鉴定后表明,其主要有效成分为木霉素。有关木霉素的制备方法以及应用等已经申请了专利。本实验利用气相色谱法对木霉素的检测方法进行了初步探索。旨在为木霉素的菌种选育、发酵工艺及分离提取等研究过程中,建立一套快速检测技术。1仪器和试剂盒1.1仪器Agilent6890气相色谱仪,包括自动进样器、柱温箱、氢火焰离子检测器。1.2试验药物和试验试剂木霉素对照品(中国计量学院生物安全与食品科学研究所,纯度为99.9%)。甲醇(色谱纯)、乙酸乙酯(分析纯)。2气相色谱评价的定性方法2.1氢火焰离子检测色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5%苯基甲基硅氧烷为固定液,30m×320μm,0.25μm);检测器:氢火焰离子检测器(FID),检测器温度270℃;进样口温度250℃;柱温度:程序升温,初始温度100℃,保持5min,以10℃·min-1升温至260℃保持5min,载气:氮气;流速1.5mL·min-1;不分流,以甲醇为溶剂。2.2对照溶液的制备精密称取木霉素对照品0.05g,用甲醇配成质量浓度为0.5g·L-1的溶液,即得储备液,备用。2.3乙酸乙酯的制备取含有木霉素的发酵液1L放入分液漏斗中,加入500mL乙酸乙酯,振荡下萃取20min,静置30min后分出乙酸乙酯层,重复萃取3次,合并乙酸乙酯层。真空浓缩至干,用甲醇洗入100mL容量瓶并用甲醇定容,待测。2.4结果在“2.1”色谱条件下,将样品色谱图与木霉素对照品色谱图进行对照,根据保留时间进行样品中木霉素定性。对照品和样品的气相色谱图见图1。2.5不同的样品溶液按“2.3”项下操作制备5批不同批号(20071120,20071125,20071203,20071211,20071220)的样品溶液,按“2.1”项下条件测定,结果均检测出木霉素。3测定固相色谱的定量方法3.1检测限的确定精密吸取“2.2”对照品储备液,分别稀释成0.4,0.2,0.1,0.05,0.025,0.01g·L-1的溶液,精密吸取1μL,分别注入气相色谱仪,以峰面积(A)对质量浓度(ρ)进行线性回归,回归方程式为:A=299.46ρ-1.4024,r=0.9999,可见木霉素在0.01～0.5g·L-1内线性关系良好。取对照品溶液0.1g·L-1按“2.1”项下条件,连续进样5次,以峰面积计算精密度,RSD(%)为0.2。分别取3种不同浓度的对照品适量,加入到一定量已知含量的样品中,按“2.3”项进行处理,得到平均回收率为99.76%,RSD(%)为1.69。结果见表1。精密量取同一批次的发酵液7份,按“2.3”项处理测定,测得平均含量为0.138g,RSD(%)为0.35,结果表明,本法重复性好。取同一供试品溶液,分别于1,2,3,4,8,24h进样测定,RSD(%)为0.75,表明样品溶液在24h内保持稳定。通过逐级降低质量浓度,进样测定,确定木霉素的最小检测限(S/N=3)为50μg·L-1。按“2.3”项下操作制备5批样品(批号同“2.5”)溶液,按外标法定量,测定结果分别为138.8,139.1,138.2,138.6,139.5mg。4每次1000公里本实验所建方法分离度好,结果准确可靠,测定方法简单、快速、重复性好,可用于