肾衰造膜方法的研究实验报告

实验报告实验名称：肾衰造膜方法的探究实验目的：了解动物造模的基本方法与注意事项；用HgCl2和甘油两种不同的药物对家兔制造肾衰模型并进行尿量、血压、肾的大体与镜下观察的分析；了解关于肾衰分析的基本生化实验内容与实验操作；了解并经历一个完整的实验研究的基本过程，初步全面接触科研实验研究；实验原理：急性肾衰竭（ARF）是以迅速的肾小球率过滤下降和血肌酐及尿素氮上升为特点的一个临床综合征。根据发病原因可将急性肾衰分为肾前性、肾性、肾后性三大类。本次实验采用的是急性肾性肾衰造模—中毒性（HgCl2）肾衰和甘油模拟的挤压综合症。汞中毒引起急性肾衰机制:汞在肾内主要积存于近曲小管，引起急性肾小管坏死，导致近曲小管重吸收功能障碍；汞也可以损害肾小球毛细血管屏障系统，造成蛋白滤出增多。甘油模拟挤压综合症引起急性肾衰机制：①大量肌红蛋白由肾小球滤过，流经肾小管时，在酸性尿液中形成不溶性的酸性正铁血红蛋白管型，阻塞肾小管②严重创伤时，刺激机体大量缩血管物质释放，导致肾血流量降低，肾小管上皮细胞缺血坏死。用HgCl2和甘油模拟家兔肾脏衰竭，对注药后40h家兔的血液、尿液进行生化分析，对其肾脏进行大体及显微镜下形态实验学分析，并通过这些结果对造模效果进行评估，从而找到一个较好的肾衰造模方法。实验材料：器材：手术器械一套、试管架、试管、离心管、微量移液器、注射器、兔笼、兔台、棉布、纱布、752分光光度计、离心机、常温水浴器。药品：1%HgCl2、50%甘油、25%乌拉坦、1%肝素、糖盐水动物：家兔实验步骤：造模：抓取体重相近，健康状况良好的家兔，称重，1%HgCl2以0.25ml/Kg耳缘静脉注入，初次实验50%甘油12ml/Kg腿部肌肉注入，第二次实验50%甘油15ml/Kg腿部皮下注入，不同家兔做好不同标记以便区分，做好实验记录，正常给水给食喂养。手术：于造模后40h左右进行手术，抓兔，称重，25%乌拉坦耳缘静脉缓慢注入，将家兔固定于兔台，由耳缘静脉注入40ml糖盐水以利于兔产尿，将1%肝素2.5ml/Kg耳缘静脉注入进行全身肝素化。剪毛，依次进行气管插管、颈动脉插管。打开动脉夹，取5ml血液于试管中以备生化实验之用，之后将动脉导管连于血压换能器上测量血压。在第三次实验中，加注10mg酚多拉敏进行降压。暴露膀胱，用注射器取出宿尿1ml于试管内以备生化实验之用，之后进行膀胱插管并将其连接于计滴器，记录尿速、尿色、10分钟的尿量。取肾，记录肾长、宽、高、皮髓质颜色、形态等大体观，做好标记并将其保存于福尔马林溶液中以备制作切片进行形态实验学观察。生化实验：将取出的兔血液和尿液分别装入空白管、标准管和测定管中，分别加入不同生化试剂，将血液各试管离心，将尿液各试管水浴加热，之后再分别放入分光光度计中，记录各结果。具体步骤、剂量及公式如下：A、血浆样本制作：取10ml离心管，动脉插管放血5ml离心3000r/min,10分钟离心取血浆，注意不要取到底下的血细胞，作为样本待用B、血肌酐测定步骤取10ml离心管，加入血浆样本0.2ml,以及试剂二2ml，混匀离心3000r/min10min，上清为血浆蛋白滤液三根塑料管，标记BCr空白管、BCr标准管、BCr测定管，三个管中加入试剂三0.5ml再分别加入试剂四0.5ml空白管——蒸馏水1.6ml；标准管——试剂一1.6ml；测定管——血浆蛋白滤液1.6ml混匀，37摄氏度水浴10分钟，流水冷却。分光光度计510nm，空白管调零，测吸光度值公式：血肌酐（umol/l）=（测定管吸光度/标准管吸光度）*标准管浓度（10umol/l）*11C、尿蛋白定量测定步骤三根塑料管，标记Upro空白管、Upro标准管、Upro测定管，三个管中加入试剂BBC3ml空白管——蒸馏水0.05ml；标准管——蛋白标ml准液0.05ml；测定管——尿液样本0.05ml3、混匀，放置五分钟。4、分光光度计595nm，空白管调零，测吸光度值5、公式：尿蛋白浓度（mg/l）=（测定管吸光度/标准管吸光度）*标准管浓度（750mg/l）D、血尿素氮测定步骤三根玻璃管，标记BUN空白管、BUN标准管、BUN测定管，三个管中加入试剂一2.5ml，酸溶液2.5ml;2、空白管——蒸馏水0.05ml；标准管——血尿素氮标准品0.05ml；测定管——血浆样本0.05ml3、混匀，沸水水浴15分钟，立刻自来水冷却。4、分光光度计595nm，空白管调零，测吸光度值5、公式：尿素氮含量（mg/l）=（测定管OD-空白管OD/标准管OD-空白管OD）*280.1实验结束：清理兔台、兔笼，清洗手术器械和生化实验试管，擦净桌面，关闭手术灯和计算机。实验结果：家兔编号第一次实验第二次实验第三次实验HgCl兔甘油兔HgCl兔甘油兔HgCl兔药物途径i.v.i.m.i.v.皮下i.v.剂量1%0.25ml/Kg0.8ml50%12ml/Kg22.8ml1%0.25ml/Kg0.48ml50%15ml/Kg30ml1%0.25ml/Kg0.53ml药物作用时间42h17h42h40h40h尿量（滴/分）无尿26——7无尿尿色淡黄色酱油色淡黄色咖啡色淡黄色血压（mmHg）162/108108/79动脉插管前死亡118/64药前122/90药后85/74血肌酐（μmol/L）711.89346.6107.7658.37774.4血尿素氮303.63g/L174.75g/L1189.58mg/L923.86mg/L——尿蛋白肾重量918.75mg/L14.1g1533.87mg/L9.8g315.97mg/L8.0g399.31mg/L7.8g3320.91mg/L10.0g系数（肾重/体重）0.006130.00530.004850.004460.00513肾尺寸（长宽高）3.9/2.8/2.0cm3.4/2.3/1.6cm3.0/2.5/1.8cm2.9/2.1/1.1cm3.4/2.2/1.9cm肾颜色皮质发白髓质暗红皮质发白髓质暗红外观发白外观暗红外观灰白大体观肿大、包膜完整、有小出血点肿胀不明显、包膜完整包膜完整包膜完整包膜完整，有出血点镜下观急性肾衰++++急性肾衰+坏死++管型+++-实验分析：注入HgCl2的家兔无尿液产生，膀胱中原储存的尿液的颜色为淡黄色，并未有酱油色或咖啡色尿液现象，可能是肾小球的滤过率降低使得尿液产生大大减少，而肾小球的内膜没有损伤，没有血细胞进入尿液造成的。注入HgCl2的家兔肾脏的大体和切片观的结果源于：重金属的直接毒性引起肾小管功能障碍、急性坏死，使流经致密斑尿液的流速减慢、钠量增高，从而通过“管-球反馈”机制激活肾素-血管紧张素系统，导致血管痉挛、肾缺血，肾皮质发白；汞在肾内主要积存于近曲小管，可引起近曲小管重吸收功能障碍，汞也可能损害肾小球毛细血管的屏障系统，使蛋白质滤出增多，从而导致大量蛋白丢失，血浆胶体渗透压降低，引起肾水肿、肾重量增加、尿蛋白增加；肾髓质血管扩张充血，髓质暗红；汞对肾小球的作用较少，所以肾小球的改变不明显。注入HgCl2的家兔，汞在肾内主要积存于近曲小管，可引起近曲小管重吸收功能障碍，汞也可能损害肾小球毛细血管的屏障系统，使蛋白质滤出增多，从而导致大量蛋白丢失，尿蛋白增加；肾衰竭时，肾排泄肌酐的能力减弱，所以血清肌酐含量增加；尿素氮是蛋白质代谢的最终产物，经肾小球滤过后被肾小管重吸收，肾衰竭时，肾小管重吸收功能障碍，所以血尿素氮的含量增加。注入甘油的家兔有尿液产生，尿液的颜色为酱油色或咖啡色，可能是甘油兔的肾小球滤过率降低不明显，有尿液产生，而肾小管损伤不严重，重吸收功能尚好，最终由尿液产生；而尿液中有大量肌红蛋白，使得尿液变为酱油色或咖啡色。注入甘油的家兔肾脏的大体和切片观的结果源于：严重创伤时，机体内释放大量肾上腺素、去甲肾上腺素、加压素、血管紧张素Ⅱ、血栓素、内皮素等血管活性物质使肾内小血管发生痉挛收缩，造成肾缺血；当损伤发生低容量休克时，导致肾血流量不足继而使肾小管缺血，髓质发白；大量肌红蛋白由肾小球滤出后流经肾小管时在酸性尿液中形成不溶性的酸性正铁血红蛋白管型，积沉在肾小管，同时还使肾小管上皮发生变性坏死，肾小管重吸收功能降低，从而导致肾水肿，并且有肾重量增加。可能由于甘油注入途径、注入时间、注入部位不恰当等原因，在本次造模实验中，各项结果不典型，还需进一步改良。注入甘油的家兔，可能由于大量血肌酐、钾离子、酸性代谢产物等毒性物质损害肾小球毛细血管的屏障系统，使蛋白质滤出增多，从而导致大量蛋白丢失，尿蛋白增加；肾衰竭时，肾排泄肌酐的能力减弱，所以血清肌酐含量增加；尿素氮是蛋白质代谢的最终产物，经肾小球滤过后被肾小管重吸收，肾衰竭时，肾小管重吸收功能障碍，所以血尿素氮的含量增加。可能由于甘油注入途径、注入时间、注入部位不恰当等原因，在本次造模实验中，各项实验室结果相比于HgCl2兔不明显，还需进一步改良。部分生化实验结果数据较大，可能是由于实验过程中存在错误操作造成的，比如分光光度计比色杯未冲洗干净或是同一组数据未同时测定。在第一次造模实验中甘油兔死亡，可能是由于甘油注入量18ml/kg过多造成的，故在后期的实验中，将注入量改为12ml/kg。在第二次造模实验中，HgCl2兔在动脉插管手术前死亡，可能是由于麻醉剂乌拉坦注入过多导致中枢神经系统受抑死亡，也可能是由于气管插管时未将误入气管的血凝块引出致窒息死亡。10、第二次造模中甘油改用皮下注射，与第一次肌肉注射相比，效果明显，但由于第一次作用时间短，故在后续实验中可将此两种方法进行一下比较分析试验。11、在第三次造模实验中，血尿素氮的测量过程中，对照管错用空白管为对照，导致结果错误，未加记录。实验结论：HgCl2和甘油均能造成家兔肾脏急性肾性衰竭，且HgCl2比甘油实验结果更典型，家兔死亡率低。急性肾脏衰竭时，肾脏肿胀缺血，镜下肾小管损伤，细胞核消失，细胞水肿，出现大量管型，肾小球球囊腔变小。生化实验结果：尿蛋白、血肌酐、血尿素氮均增加。心得体会：1、在本次实验中，从注入HgCl2和甘油导致家兔肾衰到40h后进行手术和生化分析，再到制作切片对肾脏进行镜下观察，整个过程需要小组全体成员齐心协力、共同完成。我与其他三位成员主要负责造模与手术，全面的锻炼了自己的手术操作能力、事故应变能力、团队协作能力以及实验分析能力。而在对实验结果进行分析的过程中，我与小组其他成员参考了大量资料，也在一定程度上巩固并提升了我的理论知识。在阅读参考资料的过程中，我与小组成员发现，我们的实验可以向干预方面继续进行，从而能找到一个有效的方法治疗或是减轻肾衰。我们做如下设想：甘油兔原理：利用扩血管药物减轻甘油对肌肉组织的挤压作用，从而减轻对肾脏的毒性。步骤：取两只体重相近的健康家兔，1号兔为干预兔，2号兔为对照兔，分别皮下注射50%甘油15ml/kg于左右臀；1号兔于注药后4h进行干预：i.v生理盐水20ml/kg，4mg/kg多巴胺，呋塞米5mg/kg，并用含100mg/kgNaHCO3的糖盐水饲养。HgCl2兔原理：利用二巯基丙醇进行重金属盐解毒，从而减轻对肾脏的毒性。步骤：（1）取两只体重相近的健康家兔，1号兔为干预兔，2号兔为对照兔，分别静脉注射1%HgCl20.25ml/kg；（2